HCMV先天性潛伏感染Balb-c小鼠免疫功能檢測(cè)及pp65截短抗原在腎移植標(biāo)本檢測(cè)中的應(yīng)用研究.pdf

1、目的:第一部分 HCMV先天性潛伏感染Balb/c小鼠免疫功能檢測(cè)：對(duì)HCMV先天性潛伏感染Balb/c模型小鼠進(jìn)行病毒再激活處理后，采集鼠外周血進(jìn)行HCMV感染狀態(tài)及免疫功能狀態(tài)檢測(cè)，以期探索該小鼠模型在臨床相關(guān)疾病中的應(yīng)用價(jià)值。第二部分 pp65截短抗原在腎移植標(biāo)本檢測(cè)中應(yīng)用的研究：對(duì)腎移植患者HCMV感染狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，分析比較本室自制pp65ELISA試劑盒的特異性和敏感性，以期評(píng)價(jià)其在臨床上的實(shí)用價(jià)值。
　　 方法:第一

2、部分：隨機(jī)選取先天性潛伏感染模型小鼠6只，每只給予腹腔注射環(huán)磷酰胺（劑量150mg/kg，每周1次，共3次），使其感染狀態(tài)成為潛伏感染再激活的狀態(tài)；實(shí)驗(yàn)分組為三組，即：HCMV先天性潛伏感染組（A組）、HCMV先天性潛伏感染再激活組（B組）及HF細(xì)胞對(duì)照組（C組）24～26月齡雌性小鼠各6只，眼眶取血并引頸處死，使用淋巴細(xì)胞分離液分離血液中的外周血單核細(xì)胞。分別作如下試驗(yàn)：（1）病毒分離與鑒定：吸取0.5ml的外周血單核細(xì)胞懸液接種HF

3、細(xì)胞進(jìn)行體外細(xì)胞共培養(yǎng)的病毒分離；觀察4周后，取培養(yǎng)物對(duì)HCMV UL83、IE基因進(jìn)行PCR、RT-PCR和間接免疫熒光以確定三組小鼠的HCMV感染狀態(tài)；（2）采用間接ELISA棋盤滴定法篩選各種純度pp65抗原的特異性；（3）小鼠免疫狀態(tài)檢測(cè)：使用本室自制的pp65作為抗原包被酶標(biāo)板，進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)小鼠血清中的HCMV IgG、IgM抗體水平，流式細(xì)胞儀檢測(cè)全血細(xì)胞中CD3+/CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量與比例變化。

4、第二部分：從安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院及武警醫(yī)院采集腎移植術(shù)后患者77份尿標(biāo)本、78例血標(biāo)本，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別作如下處理：（1）HCMV病毒分離：將標(biāo)本接種至人胚成纖維細(xì)胞（HF）上，觀察病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE）；（2）采用PCR技術(shù)直接檢測(cè)標(biāo)本的HCMV IE、UL54及UL83基因；（3）分別使用pp65抗原組裝的ELISA試劑盒、珠海海泰ELISA試劑盒以及意大利DIESS試劑盒檢測(cè)77例患者血

5、漿標(biāo)本；（4）處理數(shù)據(jù)，分別將基因檢測(cè)結(jié)果與意大利DIESS試劑盒的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，以確定其對(duì)患者HCMV感染狀態(tài)診斷中的參比標(biāo)準(zhǔn)診斷試劑盒地位，再以DIESS為參比，分析比較本室pp65試劑盒及國(guó)內(nèi)海泰ELISA試劑盒的特異性和靈敏度。
　　 結(jié)果:第一部分：（1）HCMV感染狀態(tài)檢測(cè)：三組病毒分離結(jié)果檢測(cè)顯示：只有B組中的4只小鼠的病毒分離結(jié)果可觀察到HCMV復(fù)制增殖后出現(xiàn)CPE，該組細(xì)胞培養(yǎng)物PCR檢測(cè)HCMV UL83

6、 DNA為陽(yáng)性，間接免疫熒光可觀察到蘋果綠色陽(yáng)性信號(hào)；上述結(jié)果在A組和C組均為陰性；A組和B組白細(xì)胞直接PCR檢測(cè)在766bp處均可見到HCMV UL83基因特異性條帶，C組為陰性；但 RT-PCR檢測(cè)只有B組4份標(biāo)本在766bp處顯示有HCMV UL83基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物存在；（2）棋盤滴定顯示只有精純后的pp65作為抗原顯示有特異性的反應(yīng)，最適稀釋度為1:40；（3）小鼠免疫狀態(tài)檢測(cè)：pp65截短抗原間接ELISA法檢測(cè)小鼠血清中的Ig

7、G、IgM抗體水平，A、B兩組小鼠IgG抗體各有6例為陽(yáng)性，陽(yáng)性率均為100％，C組為陰性；小鼠IgM抗體僅B組有4只小鼠為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為66.67％，A、C組均為陰性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群顯示，小鼠外周血中CD3+細(xì)胞比在A、B、C三組中的均值分別為33.05％±3.39％、6.58％±3.38％、43.18％±1.67％，組間差異有顯著性（P<0.01）；CD4+細(xì)胞比在A、B、C三組中的均值依次為66.08％±1.618％

8、、59.98％±2.29％、65.78％±2.17％，B組和A組及C組差異均有顯著性（P<0.01），而在A組和C組間無明顯差異（P>0.05）；CD8+細(xì)胞比在A、B、C三組中的均值依次為23.26％±2.99％、11.50％±2.79％、18.61％±0.94％，組間差異均有顯著性（P<0.01）；CD4+CD8+細(xì)胞比在A、B、C三組中的均值依次為9.90％±1.04％、16.82％±3.20％、11.92％±1.75％，組間差異

9、均有顯著性（P<0.05）。第二部分：（1）HCMV病毒分離結(jié)果顯示均為陰性。（2）77份腎移植患者血標(biāo)本HCMV PCR檢測(cè)HCMV IE DNA，67例為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為87.0％；HCMV UL54 DNA共有9例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為11.7％，HCMV UL83 DNA 10例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為13.0％。78份尿標(biāo)本HCMV UL83 PCR DNA檢測(cè)共有13份陽(yáng)性，陽(yáng)性率為16.7％。（3）以意大利DIESS試劑盒作為參比試劑盒得到海

10、泰HCMV IgM的靈敏度為7.7％，特異性為98.4％；本室pp65HCMV IgM的靈敏度為15.4％，特異性為72.0％。（4）pp65IgG和 IgM ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性的標(biāo)本中有兩份標(biāo)本其他各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果均為陰性。
　　 結(jié)論:（1）因大劑量免疫抑制劑的使用，HCMV感染再激活小鼠出現(xiàn)了細(xì)胞免疫抑制狀態(tài)，而在該免疫抑制的小鼠群體中，精純的截短抗原pp65作為包被抗原進(jìn)行ELISA檢測(cè)抗體的結(jié)果與病毒分離及P

11、CR，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果完全一致。提示精純的pp65截短抗原可用于免疫抑制人群的HCMV IgG、IgM檢測(cè)。
　　 （2）78例長(zhǎng)期使用免疫抑制劑的腎移植患者中，經(jīng)對(duì)HCMV多個(gè)基因UL83、UL54、IE DNA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，有9名患者各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為11.5％，可判定這些患者呈現(xiàn)HCMV活動(dòng)性感染；
　　 （3）在以DIESS ELISA 試劑盒為參比試劑盒時(shí)，本室pp65ELISA試劑盒其靈敏度為15