早期被地塞米松攻擊的大鼠晶狀體蛋白的分離與鑒定.pdf

1、在臨床工作中，糖皮質(zhì)激素已經(jīng)得到廣泛、有效的使用，但是長期或大量的全身或局部使用糖皮質(zhì)激素會引起激素性白內(nèi)障。激素性白內(nèi)障多為雙眼發(fā)病，臨床表現(xiàn)以后囊下混濁為主，有時可與年齡相關(guān)性白內(nèi)障等其它類型的白內(nèi)障并發(fā)。 激素性白內(nèi)障的發(fā)病機制尚不明確，目前有蛋白質(zhì)加和物學(xué)說、氧化損傷學(xué)說、滲透壓失衡學(xué)說等多種假說。但是，早期激素性白內(nèi)障都伴有晶狀體蛋白質(zhì)的異常連接、變性、透明度降低等變化。目前，尚無資料確定是何種晶狀體蛋白質(zhì)最先受到糖皮

2、質(zhì)激素的攻擊，分離和鑒定糖皮質(zhì)激素早期攻擊的晶狀體蛋白質(zhì)，可利于今后研究這些蛋白質(zhì)的特性和功能，從白內(nèi)障最薄弱的環(huán)節(jié)入手，有可能抓住白內(nèi)障發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，為研究激素性白內(nèi)障的發(fā)病機制及尋找有效治療激素性白內(nèi)障的藥物打下基礎(chǔ)。 目的：分離與鑒定早期被地塞米松攻擊的晶狀體蛋白質(zhì)，為進一步揭示激素性白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展過程中激素對晶狀體蛋白質(zhì)的修飾作用，研究易被激素攻擊的蛋白質(zhì)的特性與功能打下基礎(chǔ)。 方法：建立離體大鼠激素性白內(nèi)障模

3、型：2 月齡雌性新鮮的大鼠晶狀體共42 只，分為3 組，對照組與不含地塞米松的培養(yǎng)液孵育，其余孵育條件與實驗組相同，實驗組與含熒光標定的地塞米松培養(yǎng)液（濃度5 μM、10 μM）孵育；每天觀察晶狀體形態(tài)及混濁程度，并隨機從各組取2 只晶狀體制作冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察晶狀體切片熒光強度，找出大鼠晶狀體孵育的最佳濃度和時間。 2月齡雌性大鼠新鮮晶狀體各50 只分別與熒光標定的地塞米松（10 μM）孵育3 d 和5 d，對照組50

4、 只與不含地塞米松的培養(yǎng)液在相同的條件下孵育相同的時間，去除囊膜后勻漿，凝膠過濾層析（Sephacry S-300HR）分離水溶性蛋白質(zhì)（流速50 ml/h，每一組份收集5ml），采用紫外分光光度計和熒光光度計分別測量所收集的每一晶狀體蛋白質(zhì)組份280nm 的光吸收值和熒光強度（INT）值，繪制洗脫圖及INT 值曲線。熒光含量較多的蛋白質(zhì)組份為地塞米松攻擊的主要蛋白質(zhì)組份，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離和鑒定熒光含量多的該蛋白質(zhì)組份，并

5、對該組份中高含量的晶狀體蛋白質(zhì)進一步進行MALDI-TOF 肽質(zhì)譜指紋圖分析，以期確定早期被地塞米松攻擊的晶狀體蛋白質(zhì)，并試圖找到地塞米松與晶狀體蛋白質(zhì)的結(jié)合位點。 結(jié)果： 1. 對照組晶狀體未出現(xiàn)明顯混濁，而5 μM 組晶狀體和10 μM 組晶狀體分別在第3 d 和第2 d 時開始出現(xiàn)混濁； 5 μM 組晶狀體孵育不同時間后在熒光顯微鏡下未見熒光顯色，10 μM 組晶狀體在孵育3 d 時開始表現(xiàn)出不同的熒光強度，至7

6、d 時晶狀體冰凍切片表現(xiàn)強熒光。 2. 實驗組晶狀體蛋白質(zhì)色譜圖顯示α-晶狀體蛋白峰的出現(xiàn)較對照組有不同時間的提前；孵育3 d 和5 d 后，10 μM 組晶狀體蛋白質(zhì)色譜圖及INT 值曲線顯示α-晶狀體蛋白對應(yīng)的INT 值較高，而β和γ-晶狀體蛋白對應(yīng)的INT值很低。 3. SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示地塞米松含量高的晶狀體蛋白質(zhì)組份的分子量約在20 KD 左右，與對照組相比較，實驗組的蛋白質(zhì)條帶增多，提示可能有較多

7、的蛋白質(zhì)聚合物或交聯(lián)物形成。MALDI-TOF 肽質(zhì)譜指紋圖分析該系列蛋白質(zhì)為αA-晶狀體蛋白，提示地塞米松攻擊的主要蛋白質(zhì)是αA-晶狀體蛋白。未能通過MALDI-TOF 肽質(zhì)譜指紋圖分析找出α-晶狀體蛋白與地塞米松結(jié)合的位點。 結(jié)論： 1. 熒光素可作為地塞米松的示蹤劑應(yīng)用在早期被地塞米松攻擊的大鼠晶狀體蛋白質(zhì)的分離與鑒定實驗中。 2. 早期地塞米松攻擊的晶狀體蛋白質(zhì)主要是αA-晶狀體蛋白。Α-晶狀體蛋白被地塞

8、米松修飾而導(dǎo)致其功能的降低，可能在激素性白內(nèi)障的發(fā)病機制中起重要作用。 創(chuàng)新點： 1．在國際上首次應(yīng)用熒光素作為示蹤劑分離和鑒定早期被地塞米松攻擊的晶狀體蛋白質(zhì)，利用熒光素標定的地塞米松與離體大鼠晶狀體進行孵育，并利用熒光顯微鏡對晶狀體冷凍切片進行觀察，確定地塞米松在晶狀體內(nèi)的分布情況，并找到了用熒光素標定的地塞米松孵育離體大鼠晶狀體的合適濃度和時間。 2．通過蛋白質(zhì)層析、熒光光度計、SDS-PAGE、質(zhì)譜分析等