α、β、γ晶狀體蛋白促大鼠RGCs突起生長(zhǎng)和存活的體外研究.pdf

1、目的既往研究發(fā)現(xiàn)晶狀體損傷可保護(hù)視神經(jīng)損傷后RGCs存活和促進(jìn)軸突再生，并證明混合晶狀體蛋白具有直接的促進(jìn)作用，但確切作用物質(zhì)是何種晶狀體蛋白(α、β或γ)我們?nèi)圆磺宄?。通過(guò)分離和鑒定LongEvans大鼠的可溶性晶狀體蛋白各主要成份(α、β和γ)后，按組分別加入離體培養(yǎng)的RGCs培養(yǎng)基中，探討晶狀體中各主要晶狀體蛋白成分對(duì)離體培養(yǎng)的RGCs突起生長(zhǎng)和存活的影響，為進(jìn)一步研究和闡明晶狀體蛋白促RGCs存活和突起生長(zhǎng)作用的機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)

2、，為視神經(jīng)損傷后再生的研究提供新的思路。 方法通過(guò)分子排阻凝膠色譜的方法對(duì)LongEvans大鼠的可溶性晶狀體蛋白各主要成份進(jìn)行分離，之后運(yùn)用SDS-PAGE電泳和肽質(zhì)量指紋質(zhì)譜技術(shù)對(duì)分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。再將獲得的有生物活性的α、β、γ晶狀體蛋白分子按組分別加入離體培養(yǎng)的RGCs培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2d、4d、6d、8d后，用LeicaQWin圖像分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)每個(gè)200倍視野下分散的、有突起生長(zhǎng)的RGCs數(shù)目和最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度。

3、 結(jié)果： 1、采用分子排阻凝膠色譜法分離可溶性混合晶狀體蛋白，每次試驗(yàn)皆能得到穩(wěn)定、可重復(fù)的凝膠色譜圖。分離的凝膠色譜圖峰有α、β-H、β-L、γ晶狀體蛋白四個(gè)蛋白質(zhì)峰。 2、SDS-PAGE電泳鑒定分離的各晶狀體蛋白質(zhì)成份顯示α、β、γ各亞基的分子量大小與文獻(xiàn)所示的各亞基分子量大小相符；肽質(zhì)量指紋質(zhì)譜結(jié)果顯示：SDS-PAGE所示的α晶狀體蛋白鑒定為alpha-crystallineA；SDS-PAGE所示的β-H晶狀

4、體蛋白鑒定為beta-crystallineB2；SDS-PAGE所示的β-L晶狀體蛋白鑒定為beta-crystallineA4;SDS-PAGE所示的γ晶狀體蛋白鑒定為gamma-crystallineD。證明所收集的蛋白質(zhì)是目的蛋白質(zhì)。 3、α晶狀體蛋白組RGCs最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度顯著較對(duì)照組長(zhǎng)，2d、6d有非常顯著性差異(p＜0.01)，4d有顯著性差異(p＜0.05)；2d、6d時(shí)，β-H晶狀體蛋白組RGCs最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度顯著

5、長(zhǎng)于對(duì)照組，統(tǒng)計(jì)學(xué)有非常顯著性差異(p＜0.01)；β-L和γ晶體蛋白對(duì)體外培養(yǎng)的RGCs突起生長(zhǎng)無(wú)明顯作用，統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)顯著性差異。 4、α和β-H晶體蛋白有保護(hù)RGCs存活的作用，平均存活8d；β-L、γ晶體蛋白組和對(duì)照組RGCs存活時(shí)間平均為6d。6d時(shí)，γ晶狀體蛋白組與對(duì)照組比較，RGCs存活數(shù)目明顯減少，有非常顯著性差異。 結(jié)論： 1、采用分子排阻凝膠色譜的方法可將LongEvans大鼠晶狀體中可溶性混合晶

6、狀體蛋白質(zhì)分離成α、β-H、β-L、γ晶狀體蛋白四種主要成分，通過(guò)SDS-PAGE電泳和肽質(zhì)量指紋質(zhì)譜的方法鑒定所收集的晶狀體蛋白成分是目的蛋白，且分離后的各主要晶狀體成分具有蛋白質(zhì)生物活性。 2、α、β-H晶狀體蛋白對(duì)離體培養(yǎng)的RGCs突起生長(zhǎng)和存活有直接促進(jìn)作用，但α晶狀體蛋白的作用效應(yīng)顯著較β-H晶狀體蛋白強(qiáng)。α晶狀體蛋白和β-H晶狀體蛋白是晶狀體來(lái)源的“神經(jīng)保護(hù)性物質(zhì)”。 3、γ晶體蛋白對(duì)RGCs突起生長(zhǎng)無(wú)明顯作