經(jīng)鼻給予不同濃度的NGF對SOC1-93A小鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖作用影響的研究.pdf

1、目的:運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病(motor neuron disease，MND)是一組病因未明的選擇性侵犯脊髓前角細(xì)胞、腦干運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、皮層錐體細(xì)胞及錐體束的慢性進(jìn)行性神經(jīng)變性疾病。肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病中發(fā)病率最高的一種類型，是選擇性累及脊髓前角細(xì)胞、腦干運(yùn)動(dòng)神經(jīng)核以及大腦運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)的進(jìn)行性致死性神經(jīng)變性病，以同時(shí)累及上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元為特點(diǎn)[1-2]。患者多在首次出現(xiàn)癥狀

2、后的3～5年內(nèi)因肌肉逐漸萎縮無力、呼吸衰竭而死亡。目前，臨床上除利魯唑可以有限的延緩患者病程外，尚無有效治療手段[3]。干細(xì)胞移植治療、基因治療等新方法尚在研究中[4-6]，家族性ALS占5～10％，其中20％與銅/鋅超氧化物歧化酶(SOD1)基因突變有關(guān)。
　　神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)由Levi Montalcini于20世紀(jì)50年代首次在小鼠肉瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。NGF具有維持神經(jīng)干細(xì)胞的存活，

3、促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化及遷移，抑制細(xì)胞凋亡，營養(yǎng)神經(jīng)元，保護(hù)和修復(fù)受損神經(jīng)等效應(yīng)[7]。NGF可促進(jìn)體外培養(yǎng)的神經(jīng)前體細(xì)胞分化成未成熟的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞。NGF有促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞存活、增殖、分化及定向遷移等作用，有助于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后神經(jīng)的再生及修復(fù)，為MND治療帶來了希望。由于肝臟的首過效應(yīng)和血腦屏障(Blood-brain barrierBBB)的阻擋，經(jīng)典的靜脈及皮下給藥途徑并未使藥物最大程度的發(fā)揮效應(yīng)。SOD1-G93A

4、轉(zhuǎn)基因小鼠是國際上公認(rèn)、代表家族性ALS的動(dòng)物模型。所以，本實(shí)驗(yàn)研究采用經(jīng)鼻給予SOD1小鼠不同濃度的NGF觀察其腦內(nèi)海馬齒狀回的BrdU、Nestin的表達(dá)及神經(jīng)元的數(shù)量的方法，評價(jià)其對SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖調(diào)節(jié)作用，旨在尋找一種可以使NGF繞過BBB并在中樞靶部位迅速達(dá)到最佳效應(yīng)濃度的新型給藥途徑。
　　方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ图胺纸M:100天雌性非轉(zhuǎn)基因正常對照組小鼠6只，分為A組;國際公認(rèn)的100天

5、（癥狀期）SOD1-G93A雌性轉(zhuǎn)基因小鼠36只（均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供），隨機(jī)分為:B組（空白對照組）6只;C組（經(jīng)鼻給藥組）30只。再按照經(jīng)鼻給予NGF不同濃度，將經(jīng)鼻給藥組分為:C1組（15mg/kg濃度組）;C2組（20mg/kg濃度組）、C3組(25mg/kg濃度組)、C4組（30mg/kg濃度組）、C5組（35mg/kg濃度組），每組6只。
　　2.給藥途徑及方法:A組及B組經(jīng)鼻給予生理鹽水，C組經(jīng)鼻給

6、予NGF，給藥量每次給予5ul，間隔2min再次給藥，根據(jù)各組分別給予總量A:15ul、B:15ul、C1:15ul、C2:20ul、C3:25ul、C4:30ul、C5:35ul。用同樣給藥方法連續(xù)給3天藥。
　　3.各組隨機(jī)取一半標(biāo)本通過免疫組織化學(xué)染色以顯示內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞及腦內(nèi)增殖細(xì)胞。進(jìn)行圖像分析并計(jì)數(shù)Nestin和Brdu陽性細(xì)胞數(shù)目，分析比較A組、B組、C組之間腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞增殖及內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的變化情況。

7、
　　4.另一半標(biāo)本腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉(40mg/Kg)對小鼠進(jìn)行麻醉后，斷頭取腦，腦組織中分離出海馬組織，采用Western-Blot法檢測Nestin和Brdu蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.H.E.及Masson染色結(jié)果顯示:A組中，海馬齒狀回存在較少BrdU陽性細(xì)胞。B組皮質(zhì)均有較多的Nestin和Brdu陽性細(xì)胞，同時(shí)雙側(cè)的海馬齒狀回區(qū)也有Nestin陽性細(xì)胞，但該區(qū)域Brdu陽性細(xì)胞數(shù)量相對較少;但C

8、1-C5組Nestin和Brdu陽性細(xì)胞數(shù)目均有明顯增多（P＜0.05）;當(dāng)NGF濃度達(dá)到25mg/kg以后，隨著濃度增加，Nestin和Brdu陽性細(xì)胞增殖數(shù)目較以前增殖不明顯。
　　2.Western Blot相關(guān)蛋白基因變化:Western blot檢測結(jié)果顯示:正常對照組腦內(nèi)有一定水平的Nestin和Brdu蛋白表達(dá);B組小鼠相對于正常對照組小鼠海馬區(qū)齒狀回Nestin和Brdu蛋白表達(dá)較高。C組中隨著經(jīng)鼻給藥劑量逐漸加大

9、，Nestin和Brdu蛋白表達(dá)也隨之逐漸增高，但C4、C5組蛋白表達(dá)較C3組有所減弱，差異有顯著性意義(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.癥狀期SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)有內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖，說明本實(shí)驗(yàn)操作效果明顯。
　　2.NGF對SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)作用與其給藥量密切相關(guān)。低給藥量時(shí)(15ul)，主要表現(xiàn)為對腦內(nèi)某些神經(jīng)元的保護(hù)作用，對內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖作用較強(qiáng)，當(dāng)給藥量大于25ul以上時(shí)，對神經(jīng)干細(xì)胞