可注射細胞微球明膠復合物聯(lián)合血小板裂解液在牙組織工程中的應用研究.pdf

1、口腔臨床治療過程中，觀察視野及手術入路狹小，同時齲洞、根管等臨床常規(guī)治療部位的解剖形態(tài)復雜多變，操作時間亦受到限制。上述臨床實際均限制了體外預成型類生物支架材料的應用，不利于組織工程技術在口腔臨床治療領域的普及。而可注射性支架材料因具有一定流動性，故可通過簡便、微創(chuàng)的注射方式將搭載的細胞或生物活性物質遞送至特定部位，并在體內固化成形以貼合適應不規(guī)則缺損。本課題組成員前期分別構建了兩種可注射性的生物材料：納米纖維微球載體（nanofibr

2、ous microspheres，NF-MS）及明膠支架（Gelatin）。NF-MS已被前期研究證實，相較于傳統(tǒng)的實心微球載體（solid-interior microspheres，SI-MS），在促進軟骨細胞黏附、增殖及軟骨組織再生等方面具有更為理想的生物學效應；而Gelatin具有體內交聯(lián)固化成形的水凝膠特征，能夠在包被細胞或生物活性物質的基礎上，維持一定時間內細胞等有效包被成分在特定部位的聚集。本研究擬基于上述兩種可注射性支架

3、材料，嘗試構建復合運用兩者的新模式；并以牙髓干細胞（dental pulp stem cells，DPSCs）為種子細胞，同時引入血小板裂解液（platelet lysate，PL）作為生長因子來源；綜合上述要素，針對此模式應用于體內牙髓牙本質再生的可行性，進行前期基礎性研究，以期為后續(xù)的相關研究及臨床應用提供新的思路及實驗基礎。本研究主要結果及結論如下：
　　1．DPSCs復合微球載體培養(yǎng)模式下，相較于SI-MS，NF-MS能夠

4、顯著促進DPSCs的體外黏附、增殖及礦化；而培養(yǎng)環(huán)境中PL的引入在協(xié)同擴大NF-MS上述優(yōu)勢的同時，也使得培養(yǎng)中后期生長于SI-MS上的DPSCs的上述活力顯著高于同期NF-MS上未受PL刺激的DPSCs，表明PL在一定程度上彌補了SI-MS的原有劣勢。細胞/微球復合物經(jīng)過體外7天的礦化預刺激后，注射于裸鼠皮下8周，取材觀察結果顯示 NF-MS/PL組移植物內可觀察到牙髓牙本質復合體樣結構的形成，且新生組織的量及鈣含量均顯著優(yōu)于其他組，

5、而NF-MS組與SI-MS/PL組間各定量指標無顯著性差異，SI-MS組體內組織新生能力相對弱于上述三組。上述結果表明DPSCs復合微球載體培養(yǎng)時，結合NF-MS與PL兩者的優(yōu)勢，可以顯著促進細胞/微球復合物體外、體內的成牙能力。
　　2．DPSCs復合Gelatin培養(yǎng)模式下，Gelatin對DPSCs的生長具有良好的支持效應；同期包被入Gelatin水凝膠的PL在細胞/明膠復合物5天的體外培養(yǎng)周期內，能夠顯著促進復合物內 DP

6、SCs的增殖；而細胞/明膠復合物注射入裸鼠皮下8周后，Gelatin組及 Gelatin/PL組移植物內均未形成具有特征性結構的硬組織，僅可觀察到散在的鈣化組織。上述結果表明，雖然Gelatin能夠基于其內包被的諸如PL等營養(yǎng)或活性物質在一定時間內支持、促進DPSCs的體內外活性，但其單獨使用時并無顯著支持DPSCs體內形成特征性硬組織、尤其是牙原性組織的材料屬性，因而在后續(xù)實驗中需要與前述的微球載體復合應用加以觀察比較。
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7、．細胞/微球/明膠復合培養(yǎng)模式下，采用分階段復合方式構建細胞/微球/明膠復合物：DPSCs與微球載體于體外先期復合培養(yǎng)，期間以含有PL的條件培養(yǎng)基對細胞/微球復合物進行預刺激，以調整細胞至理想生長狀態(tài)；隨后細胞/微球復合物經(jīng)由Gelatin包被，形成細胞/微球/明膠復合物用于體內、外觀察。結果顯示：體外培養(yǎng)環(huán)境中，Gelatin內包被的PL在5天的培養(yǎng)周期內維持了NF-MS結合PL獲得的細胞先期生長優(yōu)勢，并在此基礎上進一步促進細胞/微球

8、/明膠培養(yǎng)階段 DPSCs的體外增殖活力；裸鼠體內移植8周后NF-MS/Gelatin組及NF-MS/Gelatin-PL組均形成了牙髓牙本質復合體樣組織，而SI-MS/Gelatin組及SI-MS/Gelatin-PL組僅形成了骨樣組織，相同微球載體組間的樣本鈣含量無顯著性差異。上述結果表明，細胞/微球/明膠復合物形式下，PL促進DPSCs體內形成牙原性組織的效應是建立在前期對細胞/微球復合物的預刺激的基礎上的，當PL以包被入Gela