肌肉注射sRAGE基因對STZ誘導的高脂餐大鼠2型糖尿病發(fā)病的影響.pdf

1、背景高脂肪飲食已經成為當前主要的飲食結構，與已成流行趨勢的2型糖尿病發(fā)病相伴隨。高溫烹制的高脂肪餐富含晚期糖基化終末產物(Advanced glycation end products，AGEs，又稱糖毒素，glucotoxing)。AGEs與其受體(RAGE)結合后可誘導發(fā)生氧化應激，導致胰島素抵抗(insulin resistance，IR)。IR是2型糖尿病主要發(fā)病機制之一。因此推測：長期進食富含AGEs的食物，使循環(huán)中AGEs超

2、過了機體的清除能力；AGEs可以通過與其受體RAGE結合，使體內氧化應激水平升高，導致胰島素抵抗，從而引起糖尿病發(fā)病。抑制AGEs形成、促進AGEs降解、阻斷AGEs與RAGE的結合可減輕機體的氧化應激。因此，干預AGEs-RAGE系統(tǒng)可能有助于阻斷糖尿病的發(fā)病過程。 目的：構建大鼠可溶性RAGE(soluble RAGE，sRAGE)基因表達載體，觀察sRAGE表達對高脂餐誘導的大鼠體內氧化水平以及對大鼠糖尿病發(fā)病率的影響。

3、 方法 1.sRAGE基因克隆及表達載體構建從大鼠肺組織中提取總RNA，根據其編碼區(qū)基因設計引物，并在引物中加入SalI和ClaI酶切位點；行RT-PCR，將RT-PCR產物克隆到pMDl8-T simple Vector中篩選陽性克隆并對插入片段(sRAGE)測序。用SalI和ClaI酶切pMD 18-sRAGE，得到插入片段sRAGE，將該片段定向克隆至pLNCX<,2>質粒的CMV啟動子的下游(命名為pLNCX<

4、,2>-sRAGE)，篩選陽性克隆并對插入片段(sRAGE)測序。 2.質粒擴增與純化應用大腸桿菌擴增pLNCX<,2>-sRAGE以及pLNCX<,2>，堿裂解法提取質粒。 3．大鼠骨骼肌注射pLNCX<,2>-sRAGE后sRAGE表達的檢測取雄性SD大鼠6只(體重300g±10g，12周齡)，隨機分為2組。一組單側骨骼肌轉染pLNCX<,2>-sRAGE質粒300gg，一組單側骨骼肌轉染pLNCX<,2>質粒30

5、0μg，各組大鼠轉染后均使用轉基因儀給予方波電脈沖刺激增強其轉染效率；一周后處死動物，取注射部位肌肉提取總RNA，并使用RT-PCR的方法檢測sRAGE基因在大鼠肌肉組織mRNA水平的表達。 4．大鼠骨骼肌注射pLNCX<,2>-sRAGE對大鼠體內氧化水平的影響4．1 預實驗雄性SD大鼠12只(體重150～160g，6周齡)，隨機分為3組，每組4只： (1)高脂餐喂養(yǎng)+pLNCX<,2>-sRAGE組：高脂飼料喂養(yǎng)8周后雙側股

6、四頭肌轉染pLNCX<,2>-sRAGE質粒，每側300gg。 (2)高脂餐喂養(yǎng)+pLNCX<,2>組：高脂飼料喂養(yǎng)8周后雙側股四頭肌轉染pLNCX<,2>質粒300μg。 (3)普通飼料對照組：喂養(yǎng)普通飼料，未轉染質粒。各組大鼠于轉染質粒前以及轉染后每一周取血，檢測血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)。 4．2正式實驗雄性SD大鼠20只(體重150～160g，6周齡)，隨機分為2組(每組10只)： (1)高脂餐喂養(yǎng)

7、+pLNCX<,2>-sRAGE組，(2)高脂餐喂養(yǎng)+pLNCX<,2>組。質粒轉染方法、劑量與預實驗同。各組大鼠在轉染第一次質粒3周時重復注射質粒一次，劑量同上；分別于2次轉染前以及轉染后7天、14天、21天、斷尾取血測定SOD、MDA，評價其體內的氧化水平。 5．肌肉注射pLNCX<,2>-sRAGE轉染對大鼠糖尿病發(fā)病率的影響方法4.2中高脂喂養(yǎng)的2組大鼠(每組n=10)在第二次轉染質粒后的第三周后腹腔注射鏈脲佐菌素(S

8、TZ)30mg/kg：另取普通飼料喂養(yǎng)的20周齡雄性SD大鼠10只(350-380g)，隨機分為2組：一組(n=5)注射同等劑量STZ(3 0mg/kg)；另一組(n=5)注射生理鹽水。一周后測空腹血糖，以空腹血糖≥7.0mmol/L為達到糖尿病診斷標準。 6．高脂喂養(yǎng)的大鼠不同處理組血胰島素水平及胰島胰島素含量情況高脂喂養(yǎng)的大鼠注射STZ前采血，ELISA法測定血清胰島素水平以及血糖水平。注射STZ一周后處死大鼠，取胰腺固定

9、，石蠟切片，行胰島素免疫組化染色，觀察胰島細胞胰島素分泌情況。 結果 1．酶切和測序證實構建的sRAGE基因表達載體序列正確。 2．肌肉注射pLNCX<,2>-sRAGE后，注射部位肌肉mRNA用RT-PCR可以檢測到sRAGE的mRNA表達。 3.高脂飲食+pLNCX<,2>-sRAGE組與高脂喂養(yǎng)+pLNCX<,2>組體重無統(tǒng)計學差異(382g vs 380g，t=0.120，p=0.906)。

10、 4.轉染pLNCX<,2>-sRAGE后大鼠體內MDA水平開始下降，其作用可持續(xù)3周，第2周起的水平與對照組相比有統(tǒng)計學差異(5.36 vs 6.79，t=-7.458，p=0.000)；SOD水平逐漸上升，第3周開始與對照組相比有統(tǒng)計學差異(152 vs 140，t=2.801，p=0.025)。重復注射后，MDA水平仍然可以下降，趨勢同前；SOD水平則繼續(xù)升高，但在第二次轉染后2周后達到一定水平后則不再升高。 5.肌

11、肉注射pLNCX<,2>-sRAGE組大鼠注射小劑量STZ后10只中僅有2只大鼠空腹血糖>7.0mmol/L，對照組10中則有8只空腹血糖>7.0mmol/L。普通飼料喂養(yǎng)的2組大鼠無糖尿病發(fā)生。三組空腹血糖均值有統(tǒng)計學差異。 6.高脂喂養(yǎng)并肌肉注射pLNCX<,2>-sRAGE、注射pLNCX<,2>及普通飼料喂養(yǎng)的大鼠在注射STZ前血糖無統(tǒng)計學差異(分別為4.81±0.472mmol/L、4.92±0.45mmol/L和4.

12、96mmol/L±0.435mmol/L)； pLNCX<,2>-sRAGE組大鼠的血清胰島素水平明顯低于PLNCX<,2>組大鼠，但高于普通飲食的同齡大鼠。 7．大鼠胰島免疫組化染色顯示高脂喂養(yǎng)的2組大鼠胰島分泌胰島素含量均低于普通飲食組大鼠。與pLNCX<,2>組大鼠比較pLNCX<,2>-sRAGE組大鼠胰島結構更加完整，胰島素含量更接近普通飲食大鼠。 結論 1.成功地構建了大鼠sRAGE基因表達載體pL