卵巢癌早期診斷標(biāo)志物的蛋白組學(xué)分析及GRPsiRNA對卵巢癌細胞ES2生物學(xué)效應(yīng)的研究.pdf

1、1.研究背景
　　 卵巢癌是目前全球死亡率最高的婦科惡性腫瘤。究其因為,是因為卵巢的解剖位置隱匿,早期卵巢癌常缺乏臨床癥狀,而造成患者就診時往往到了晚期,晚期病人的治療過程中,常發(fā)生耐藥和復(fù)發(fā),5年生存率只有15～20％,與晚期相比,早期癌的5年生存率高達80～90％,可見提高卵巢癌的5年生存率的關(guān)鍵在于發(fā)現(xiàn)更多的早期病人。由于缺乏相應(yīng)的高度特異性的標(biāo)志物,卵巢癌的早期診斷仍是其研究的一個瓶頸問題,因此,卵巢癌的早期診斷仍是目前

2、研究的熱點。目前臨床上多采用陰道B超結(jié)合CA125早期診斷卵巢癌,但是盡管這樣也只能發(fā)現(xiàn)25％左右的早期病例,診斷性腹腔鏡能夠發(fā)現(xiàn)100％的卵巢癌病人,但是其有創(chuàng)傷性和昂貴的價格限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。卵巢癌早期診斷標(biāo)志物的研究中,多數(shù)學(xué)者采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法進行篩選,其最大的優(yōu)勢在于能夠從整體水平把握整個疾病的病理生理狀態(tài),傳統(tǒng)的蛋白組學(xué)方法有2-DE、多維凝膠電泳,但是這些方法的可重復(fù)性較低且費時費力,近年來激光解析電離飛行時間質(zhì)

3、譜和基質(zhì)輔助電離飛行時間質(zhì)譜兩大技術(shù)飛速發(fā)展,尤其是前者目前多用于血清標(biāo)志物的篩選,但其可重復(fù)性仍然較差,隨著研究的日益成熟,一些學(xué)者采用磁珠結(jié)合MALDI技術(shù)進行腫瘤標(biāo)志物篩選的研究時發(fā)現(xiàn)該方法的可重復(fù)性較高,認為這與磁珠表面的疏水特性有關(guān)。
　　 較早的蛋白組學(xué)研究多采用血清標(biāo)本來進行疾病蛋白質(zhì)的篩選,近年來隨著蛋白質(zhì)分離技術(shù)、質(zhì)譜分析技術(shù)和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫生物信息學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展,唾液、膽汁、腹水、囊液等體液也被用來進行蛋白質(zhì)

4、組學(xué)的研究,目前多數(shù)研究仍集中在血清標(biāo)志物篩選上,但血清蛋白來自全身,器官特異性較低,很難從大多數(shù)無癥狀人群中捕獲盡可能多的真正患病的個體,相比較而言,各種體液蛋白質(zhì)組學(xué)研究所篩選的標(biāo)志物具有特異性高的優(yōu)勢。最近,雖有將卵巢癌患者的囊液和腹水用來篩選早期診斷標(biāo)志物的研究,但是將各個期別的卵巢癌作為一個研究組與對照組進行對照研究,勢必會遺漏一些早期病變的標(biāo)志物。
　　 很顯然,將卵巢癌分為早期組和晚期組,并將血清、腹水和囊液相結(jié)合

5、用以篩選早期診斷的標(biāo)志物,將會大大提高所篩選標(biāo)志物的特異性和敏感性。因此本研究采用基于磁性微球的MALDI-TOF-MS、免疫組化、酶聯(lián)免疫吸附試驗技術(shù),首先將卵巢癌患者分為早期組和晚期組分別與兩個對照組進行比對研究,進一步在腹水和囊液中篩選卵巢癌相關(guān)侯選蛋白和早期診斷標(biāo)志物,從蛋白水平探討卵巢癌的血清和組織分子變化特征和規(guī)律,并采用小干擾RNA技術(shù)初步探討篩選標(biāo)志物的生物學(xué)功能,加深對卵巢癌癌變機制的了解,并為進一步發(fā)掘卵巢癌早期發(fā)現(xiàn)

6、的分子指標(biāo)和手段提供重要的理論基礎(chǔ)和信息。
　　 2.材料與方法
　　 2.1研究對象
　　 蛋白質(zhì)組學(xué)實驗:
　　 血清:訓(xùn)練集血清:卵巢癌患者30例(其中Ⅰ～Ⅱ期11例,Ⅲ～Ⅳ19例,漿液性23例,粘液性6例,內(nèi)膜樣癌1例；<50歲9例,>50歲21例,家族史陽性10例,家族史陰性20例)、良性卵巢腫瘤10例(其中漿液性8例,粘液性2例)和正常卵巢者13例的血清和配對組織,5例卵巢癌患者的腹水和囊液,

7、以上血清為訓(xùn)練集樣本,驗證集血清:卵巢癌8例(其中Ⅰ～Ⅱ期2例,Ⅲ～Ⅳ期6例)、5例卵巢良性腫瘤(其中漿液性4例,粘液性1例)和5例正常卵巢者的血清作為驗證集樣本。
　　 免疫組織化學(xué)實驗:
　　 卵巢癌和正常卵巢組織為與以上訓(xùn)練集血清配對的組織共43例,良性卵巢腫瘤組織20例(與訓(xùn)練集血清配對組織10例,與驗證集血清配對組織5例和額外收集組織5例)。
　　 酶聯(lián)免疫吸附實驗:
　　 卵巢癌和正常卵巢組為

8、訓(xùn)練集加驗證集血清共56例,良性卵巢腫瘤組25例(除訓(xùn)練集10例外,額外收集10例也作為訓(xùn)練集和驗證集5例)。
　　 小干擾RNA實驗:
　　 細胞:人卵巢癌細胞系ES2細胞
　　 2.2樣本(血清和組織)收集
　　 在2006年7月至2009年1月收集術(shù)前目清晨空腹血5ml,離心后-80℃保存待用。組織均取自術(shù)中,10％福爾馬林固定,石蠟包埋并以蠟塊室溫保存。所有病人術(shù)前均排除內(nèi)外科合并癥和腎功能不全,

9、未經(jīng)過放化療和免疫治療。術(shù)中收集腹水和囊液標(biāo)本并避免被血液污染。
　　 2.3方法
　　 2.3.1MALDI-TOF-MS結(jié)合磁性微球(磁珠)檢測血清蛋白質(zhì)組
　　 2.3.1.1樣品制備
　　 取5μl血清樣品,加入弱陽離子磁珠WCX(Bruker Daltonics,Leipzig
　　 Germany)混懸液SPE-CM2μl以及SPE-CB95μl,磁珠結(jié)合并貼壁后移去上清,再加入SPE

10、-CW100μl,反復(fù)重復(fù)操作兩次,得到制備好的血清樣品。腹水和囊液的上樣量分別為10μL和2.5μL,操作步驟和血清樣品制備相同。
　　 2.3.1.2MicroflexMALDI-TOF質(zhì)譜分析
　　 將1μl含蛋白質(zhì)的洗脫液與10μl基質(zhì)(0.3％的-α-氰基-4-羥基肉桂酸,HCCA)混合,取1μl點樣于Anchorchip靶板上,將耙板放入Microflex質(zhì)譜儀(Bruker Daltonics),用標(biāo)準(zhǔn)品(

11、Clinprot standard)校正儀器后檢測樣品,獲得不同質(zhì)荷比的蛋白質(zhì)峰構(gòu)成的質(zhì)譜圖。在血清、腹水和囊液中篩選共同升高的多肽峰。然后在http//us.expasy.ory/tools/tagident.html數(shù)據(jù)庫中檢索與之匹配的多肽。根據(jù)既往文獻報道,甄別篩選出候選多肽進行下一步驗證。
　　 2.3.2卵巢癌差異表達多肽的血清和組織驗證
　　 2.3.2.1免疫組化(IHC)
　　 采用免疫組化SP

12、法檢測卵巢癌組織、良性卵巢腫瘤組織和正常卵巢組織的相應(yīng)多肽的表達。GRP抗體(rabbit polyclonal,MAB35841 R&D Co,Ameraican')和二抗、DAB試劑盒均購自上海越研生物工程公司。實驗按照試劑盒說明書進行。
　　 2.3.2.2酶聯(lián)免疫吸附試驗(EIJSA)
　　 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測卵巢癌組、良性卵巢腫瘤組和正常卵巢組的血清相應(yīng)多肽的水平差異。GRP ELISA試劑盒(QC01-

13、1,R&D Co,American)購自上海越研生物工程公司。Pro-GRP試劑盒(H23517,Ⅳ,American)。實驗按照試劑盒說明書進行
　　 2.3.3GRPsiRNA對人卵巢癌ES2細胞的生物學(xué)效應(yīng)
　　 構(gòu)建針對GRP的發(fā)夾樣siRNA真核表達載體,人工合成GRPsiRNA的寡核苷酸鏈,導(dǎo)入p-Genesil-1.1載體(p-Genesil-1-1載體購自武漢晶賽生物技術(shù)工程公司),采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入人卵巢

14、癌細胞系ES2細胞中,采用免疫印跡法(Westernbloting)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后GRPmRNA和蛋白表達變化,采用細胞計數(shù)法檢測各組細胞增殖情況；流式細胞術(shù)觀察被轉(zhuǎn)染細胞的凋亡情況；transwell小室觀察細胞被轉(zhuǎn)染前后的穿膜侵襲力。
　　 2.4統(tǒng)計學(xué)方法和生物信息學(xué)分析
　　 采用ClinProtTM(Bruker Daltonics Company)的內(nèi)置軟件FlexAna

15、lysis3.0收集所有樣品的質(zhì)譜峰,并分析單個峰的強度。采用Top Hat和Savitsky Golay系統(tǒng)進行平滑、去噪和歸一化處理后采用遺傳算法對多肽峰進行量化。采用ClinProtTM軟件(Ver.2.2；Bruker Daltonics)將所有信噪比(S/N)>5的1000-10000Da范圍內(nèi)的信號進行處理。通過Kruskal-Wallis檢驗的P值評價每個差異峰的在不同組別的表達強度差異。采用線性支持向量機(SVM)區(qū)分各

16、組的數(shù)據(jù)并建立診斷模型,以留一法分析診斷模型的診斷敏感度和特異度。篩選出的多肽峰的診斷意義用樣品分布圖和均值標(biāo)準(zhǔn)差圖來表示。免疫組化的酶聯(lián)免疫吸附試驗的結(jié)果分別用x2檢驗和方差分析(q-檢驗)、Kruskal-Wallis法進行分析。分別采用Spearman相關(guān)性分析評價卵巢癌組的免疫組化和ELISA結(jié)果一致性和Pearson相關(guān)性分析檢驗GRP和pro-GRP這兩個血清指標(biāo)的相關(guān)性,計算ELISA結(jié)果的95％的可信區(qū)間和敏感度、特異度

17、、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值。以Pearson相關(guān)系數(shù)表示差異多肽峰和血清多肽水平的相關(guān)性。各組的轉(zhuǎn)染前后的蛋白、基因表達水平的變化和增殖、侵襲力變化采用兩樣本t檢驗分析。采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS13.0數(shù)據(jù)包進行統(tǒng)計分析。
　　 3結(jié)果
　　 3.1MALDI-TOF-MS檢測血清、腹水和囊液樣本
　　 卵巢癌組、良性組和正常組三組比較分析:良性與正常組相比無差異峰。與良性組相比,早、晚期卵巢癌組共同升高的多肽峰有2

18、881和2897Da(P<0.05)；與正常組相比,早、晚期卵巢癌組共同升高的多肽峰有2881,2897和4466Da(P<0.05)。在4例卵巢癌患者的腹水和囊液中也發(fā)現(xiàn)2881和2897Da.多肽峰均值較高。選擇早晚期卵巢癌患者血清、腹水和囊液中共同升高的2881和2897Da差異峰采用GC算法建模,經(jīng)留一法驗證,診斷卵巢癌的特異度為100％,敏感度為100％,盲法檢測的診斷特異度為100％,敏感度為87.5％。
　　 3.

19、2年齡與家族史相關(guān)候選多肽的篩選
　　 年齡<50歲和>50歲卵巢癌組與正常卵巢組相比無明顯差異多肽峰(P均>0.05),家族史陽性與陰性的卵巢癌患者,血清多肽譜與正常卵巢組相比,僅有兩個下調(diào)的多肽峰2953和1466Da一致(P<0.05),其余差異多肽峰均不同。
　　 3.3卵巢癌早診候選多肽的檢索與篩選
　　 在http://us.expasy.org/tools/tagident.html數(shù)據(jù)庫中檢索與2

20、881和2897Da匹配的多肽,依據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析及文獻檢索結(jié)果,在9種卵巢癌候選相關(guān)差異多肽中,僅胃泌素釋放肽(Gastrin-releasing peptide,GRP)在既往報道中較多提示與腫瘤密切相關(guān),其余均未見報道與腫瘤有關(guān)。
　　 3.4免疫組化和ELISA.的組織和血清驗證
　　 免疫組化結(jié)果顯示,與良性(30％)和正常組(0％)相比,GRP在卵巢癌組織中顯著高表達(早期:72.73％;晚期:78.95％),差

21、異有顯著性(x2=24.599,P=0.00)。ELISA結(jié)果顯示GRP在卵巢癌血清中顯著高于良性和正常卵巢組(P<0.05)。Pearson相關(guān)性檢驗顯示,卵巢癌患者的血清2881和2897Da差異多肽峰均值和標(biāo)準(zhǔn)差與GRP血清水平有明顯相關(guān)性(r=0.92；r=0.88；P均<0.0001)。此外,卵巢癌組織和血清中的GRP呈正相關(guān)且一致性較高(r=0.809,P=0.000),GRP與其前體pro-GRP在訓(xùn)練集人群中有明顯的相關(guān)

22、性(r=0.90,P<0.001),且pro-GRP在訓(xùn)練集人群血清中的水平顯著高于另外兩組(x2=41.81,P=0.00),其作為診斷指標(biāo)的ROC面積為0.974(z=27.88,P<0.001),cut-off值為89.2851,用于診斷卵巢癌的靈敏度為100％,特異度為90.91％,Youden指數(shù)為0.9091。對驗證集人群進行驗證的靈敏度為93.33％,特異度為80％,Youden指數(shù)為0.7333。
　　 3.5G

23、RPsiRNA對人卵巢癌細胞系ES2生物學(xué)功能的作用
　　 成功構(gòu)建人GRP的發(fā)夾樣siRNA真核表達載體GRPsiRNA,轉(zhuǎn)染ES2細胞后,其增殖能力明顯下降(P<0.05)；表達GRPmRNA和蛋白明顯降低并且凋亡率顯著下降；transwell小室顯示其穿膜侵襲能力明顯下降(P<0.05)。
　　 4結(jié)論
　　 4.1在早、晚期卵巢癌患者的血清中共同升高并在腹水和囊液也發(fā)現(xiàn)均值較高的2881和2897Da.差