出生前后不同環(huán)境對(duì)仔鼠恐懼行為的影響及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景： 孕母與胎兒的關(guān)系十分密切，任何影響母親健康的因素都有可能同時(shí)影響胎兒發(fā)育。近年來(lái)社會(huì)心理因素在妊娠過(guò)程中的作用逐漸被人們所重視。國(guó)外學(xué)者通過(guò)多種方法，制造出多種能夠產(chǎn)生負(fù)性情緒的動(dòng)物模型達(dá)到類(lèi)似社會(huì)心理應(yīng)激的效果,發(fā)現(xiàn)孕期應(yīng)激可以使其仔鼠恐懼行為加劇，并有著與人類(lèi)焦慮癥患者相似的行為、生化和解剖學(xué)的特點(diǎn)，因此，目前出生前有應(yīng)激史的仔鼠已經(jīng)成為研究焦慮癥的動(dòng)物模型。探討其發(fā)病機(jī)制以及如何逆轉(zhuǎn)其焦慮的發(fā)生將為人類(lèi)焦慮癥的預(yù)防

2、和治療提供重要的理論和實(shí)踐依據(jù)。另外，關(guān)于良好的孕期環(huán)境是否可減少其仔鼠的恐懼行為，目前尚無(wú)研究報(bào)道。 杏仁核是恐懼回路的重要組成部分，條件恐懼的細(xì)胞分子生物學(xué)機(jī)制主要集中于杏仁核中興奮性谷氨酸通路和抑制性γ-氨基丁酸(GABA)通路的相互作用，涉及細(xì)胞電生理的改變、基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)的合成。盡管GABA能中間神經(jīng)元只占了神經(jīng)元中的一小部分，但這些神經(jīng)元在興奮性神經(jīng)元間起著有力的抑制性的使興奮性神經(jīng)元同步化的作用，同時(shí)在受到刺激

3、后起著有力的前饋和反饋的抑制性突觸后電位的作用。 胃泌素釋放肽(gastrtn-releasing peptide，GRP)及其受體(GRPR)被一些研究者認(rèn)為與恐懼記憶高度相關(guān)。體外研究發(fā)現(xiàn)，GRPR基因敲除小鼠的杏仁核切片中同步性抑制水平大大降低，并且長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)(long term potentiation，LTP)增強(qiáng)，這些小鼠在Morris水迷宮中的空間記憶不會(huì)受到損害(海馬依賴的空間記憶)，但卻表現(xiàn)出對(duì)巴甫洛夫經(jīng)典

4、條件恐懼中對(duì)聽(tīng)覺(jué)線索(杏仁核依賴)和情景線索(杏仁核海馬均依賴)的長(zhǎng)期恐懼記憶的加強(qiáng)和延長(zhǎng)，同時(shí)表現(xiàn)出與恐懼記憶有關(guān)的神經(jīng)回路皮層LTP效應(yīng)加強(qiáng)，從而證實(shí)GRP對(duì)恐懼記憶起抑制性負(fù)反饋?zhàn)饔?。然而，另有研究顯示，無(wú)論給予海馬CA1區(qū)或基底外側(cè)杏仁核注射GRPR拮抗劑均可損害厭惡性條件形成，提示GRP對(duì)恐懼記憶起促進(jìn)性作用。因此，GRP及其受體與條件恐懼記憶的關(guān)系尚無(wú)肯定結(jié)果。“豐富環(huán)境”(environmental enrichment，

5、EE)被定義為復(fù)雜的、無(wú)生命物與社會(huì)刺激的復(fù)合體。環(huán)境對(duì)大腦功能及行為的影響已得到廣泛重視。有研究顯示豐富環(huán)境不僅可以明顯提高動(dòng)物的記憶和學(xué)習(xí)能力，還能減少其焦慮行為。但是目前尚無(wú)研究顯示豐富環(huán)境是否影響大腦GRPR的表達(dá)。 目的： 1.運(yùn)用已被廣泛用于評(píng)價(jià)大鼠恐懼水平的防御退縮實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，研究孕期不同環(huán)境對(duì)不同日齡仔鼠恐懼行為的影響。 2.采用經(jīng)典的孕期應(yīng)激模型，研究仔鼠的恐懼行為與杏仁核、海馬GRPR陽(yáng)性

6、細(xì)胞數(shù)量、GRPR信息RNA及蛋白表達(dá)水平的關(guān)系，試圖進(jìn)一步說(shuō)明條件恐懼過(guò)程中抑制性神經(jīng)通路所起的作用。 3.研究豐富環(huán)境是否影響仔鼠杏仁核、海馬GRPR陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量、GRPR信息RNA及蛋白表達(dá)，進(jìn)一步闡明豐富環(huán)境作用的分子機(jī)制。 研究方法： 1.孕期不同環(huán)境對(duì)不同日齡仔鼠恐懼行為的影響：將初次妊娠11天的孕鼠隨機(jī)分為：應(yīng)激組、豐富環(huán)境組和對(duì)照組，每組各4只，1只/箱。應(yīng)激組：將妊娠11-21天的孕鼠置于透明塑

7、料的固定器(直徑7cm，長(zhǎng)19cm)中并給予強(qiáng)光照射45分鐘/次，3次/天(分別在10:00，13:00和16:00點(diǎn))。豐富環(huán)境組：將孕鼠置于長(zhǎng)×寬×高為80×60×40 cm的特制飼養(yǎng)箱中，內(nèi)設(shè)：轉(zhuǎn)籠、掩體、各種顏色的塑料玩具以及其它小裝置如秋千、隧道等；其中轉(zhuǎn)籠和掩體是固定的，其他的玩具和小裝置則每星期更換。對(duì)照組不給予刺激。出生當(dāng)天將每窩仔鼠調(diào)整到10只，生后21天斷奶，4只/箱，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境喂養(yǎng)，每組16只雄性仔鼠分別于生后25天

8、、45天和60天進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和防御退縮實(shí)驗(yàn)測(cè)試。 2.豐富環(huán)境對(duì)孕期應(yīng)激仔鼠恐懼行為的影響及其機(jī)制的研究：斷奶后，將孕期應(yīng)激雄性仔鼠40只隨機(jī)分為2組，每組20只：應(yīng)激豐富環(huán)境組(SE)，置于特制飼養(yǎng)箱中,10只/箱；應(yīng)激對(duì)照組(SC)，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境喂養(yǎng)，4只/箱。另有對(duì)照組雄性仔鼠40只分組方法同上，分別稱為標(biāo)準(zhǔn)豐富環(huán)境組(CE)和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組(CC)。 生后60天進(jìn)行防御退縮實(shí)驗(yàn)測(cè)試。測(cè)試結(jié)束后，每組6只過(guò)量麻醉后灌注固定

9、取腦，分別進(jìn)行尼氏染色和GRPR單標(biāo)免疫熒光染色，計(jì)數(shù)海馬各區(qū)、杏仁核各核團(tuán)以及相應(yīng)大腦皮層GRPR陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)；其余仔鼠直接斷頭取腦，在冰上快速分離雙側(cè)海馬、杏仁核及相應(yīng)體積的大腦皮層，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR法(Real-time Quantitative RT-PCR)檢測(cè)各部位GRPR信息RNA的表達(dá)：應(yīng)用免疫印記(Western blot)檢測(cè)各部位GRPR蛋白的表達(dá)。 結(jié)果： 1.孕期不同環(huán)境對(duì)不同日齡仔鼠恐懼

10、行為的影響在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，各日齡孕期應(yīng)激仔鼠均較相應(yīng)對(duì)照組中央格停留時(shí)間延長(zhǎng)，總穿格數(shù)及站立次數(shù)減少(allp＜0.05)，提示孕期應(yīng)激可以減少其仔鼠對(duì)陌生環(huán)境的探究行為。與之相反，生后25天時(shí)豐富環(huán)境組仔鼠較對(duì)照組總穿格數(shù)增加(p＜0.05)，而中央格停留時(shí)間縮短(p＜0.05)，至生后45天、60天上述差別消失(allp＞0.05)，說(shuō)明孕期給予豐富的環(huán)境僅可以增加其幼鼠的探究行為。 在防御退縮試驗(yàn)中，生后25天時(shí)，孕期應(yīng)激仔

11、鼠較對(duì)照組潛伏期延長(zhǎng)(p＜0.05)；生后45天時(shí)，不僅潛伏期延長(zhǎng)(p＜0.05)，自小室退出次數(shù)亦減少(p＜0.05)；而生后60天時(shí)，在上述表現(xiàn)的基礎(chǔ)上，給予束縛應(yīng)激刺激后其在小室內(nèi)的時(shí)間較相應(yīng)對(duì)照組明顯延長(zhǎng)(p＜0.05)；提示孕期應(yīng)激刺激可以導(dǎo)致子代的恐懼行為增加，且隨著年齡增長(zhǎng)逐漸加劇，給予束縛應(yīng)激刺激可加劇其恐懼。與之相反，生后25天時(shí)，豐富環(huán)境組仔鼠較對(duì)照組潛伏期縮短，自小室退出次數(shù)增加，說(shuō)明孕期豐富環(huán)境可以減少幼年仔鼠的

12、恐懼行為并增加其探究行為。 2.豐富環(huán)境對(duì)孕期應(yīng)激仔鼠恐懼行為的影響經(jīng)給予豐富環(huán)境刺激，在生后60天進(jìn)行的防御退縮試驗(yàn)中，應(yīng)激豐富環(huán)境組(SE)較應(yīng)激對(duì)照組(SC)潛伏期縮短(p＜0.05)，出小室的次數(shù)增多(p＜0.05)，給予束縛應(yīng)激不再增加其在小室內(nèi)的時(shí)間(p＜0.05)，提示豐富環(huán)境可以糾正孕期應(yīng)激仔鼠異常的恐懼行為，并提高其對(duì)應(yīng)激刺激的適應(yīng)能力。 3.出生前后不同環(huán)境對(duì)杏仁核、海馬及大腦皮層GRPR陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量

13、的影響孕期應(yīng)激仔鼠(SC組)海馬CA1、CA3、DG區(qū)，杏仁外側(cè)核(LA)、中央核(CE)、基底外側(cè)核(BLA)以及相應(yīng)大腦皮層GRPR陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)較標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組無(wú)顯著性差異(all p＞0.05)；而應(yīng)激豐富環(huán)境組(SE)及標(biāo)準(zhǔn)豐富環(huán)境組(CE)在海馬各區(qū)及杏仁核各核團(tuán)GRPR陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)均較相應(yīng)對(duì)照組明顯增多(all p＜0.05)。 4.出生前后不同環(huán)境對(duì)杏仁核、海馬及大腦皮層GRPR信息RNA表達(dá)水平的影響孕期應(yīng)激仔鼠(SC組)海

14、馬、杏仁核以及相應(yīng)大腦皮層GRPR信息RNA表達(dá)水平較CC組無(wú)顯著性差異(all p＞0.05)；而SE及CE組海馬和杏仁核GRPR信息RNA表達(dá)水平較SC和CC組明顯提高(all p＜0.05)。 5.出生前后不同環(huán)境對(duì)杏仁核、海馬及大腦皮層GRPR蛋白表達(dá)水平的影響孕期應(yīng)激仔鼠(SC組)海馬、杏仁核以及相應(yīng)大腦皮層GRPR蛋白表達(dá)水平較CC組無(wú)顯著性差異(all p＞0.05)；而SE及CE組海馬和杏仁核GRPR蛋白表達(dá)水平

15、較SC和CC組明顯提高(all p＜0.05)。 結(jié)論： 1.本研究再次證實(shí)，孕期給予制動(dòng)加強(qiáng)光照射應(yīng)激刺激可以導(dǎo)致子代的恐懼行為增加，且隨著年齡增長(zhǎng)逐漸加劇，給予束縛刺激可以加劇其恐懼，這與人類(lèi)焦慮癥常在幼年發(fā)病，可持續(xù)至青春期及成年，表現(xiàn)為過(guò)多的恐懼和對(duì)不良刺激的回避基本吻合，說(shuō)明該動(dòng)物模型作為焦慮癥的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ突竞虾跻蟆?2.本次研究首次發(fā)現(xiàn)，孕期給予豐富的環(huán)境可以降低其幼鼠的恐懼水平，增加其探究行為，但

16、是這一優(yōu)勢(shì)于生后45天即消失，可能與大鼠的恐懼水平隨年齡增長(zhǎng)而增加有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。 3.本次研究首次發(fā)現(xiàn)，孕期應(yīng)激并不影響仔鼠海馬、杏仁核以及相應(yīng)大腦皮層GRPR陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量、GRPR信息RNA和蛋白表達(dá)水平，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。 4.本次研究首次發(fā)現(xiàn)，豐富環(huán)境可以增加海馬CA1、CA3、DG區(qū)，杏仁核LA、CE、BLA的GRPR陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，并提高海馬、杏仁核GRPR信息RNA及蛋白表達(dá)，同時(shí)伴有恐懼水平