TRAIL對HeLa生物活性及其作用機理的初步研究.pdf

1、腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TNF-relatedapoptosis—inducingligand，TRAIL)是繼TNF、FasL之后發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子超家族新成員，具有選擇性地誘導癌化或轉(zhuǎn)化的細胞發(fā)生凋亡，對正常細胞及人體組織安全無毒，同時，TRAIL可以不依賴p53。因此，TRAIL受到了國內(nèi)外學者的廣泛重視，有望成為新的抗腫瘤藥物。 然而，目前，TRAIL對宮頸癌的作用機理并不十分清楚，僅停留于對某一種或某幾種蛋白質(zhì)的

2、功能研究，難以在特定的時間和特定的空間整體地、系統(tǒng)地、透徹地闡釋TRAIL的作用機制。本研究以HPVl8陽性的宮頸癌細胞系HeLa為模型，通過原核表達系統(tǒng)表達的TRAIL蛋白，開展了TRAIL蛋白的生物學活性，作用靶位及作用機理的初步研究，總的結果是為TRAIL的作用靶點及作用機理提供新的理論依據(jù)。我們的研究分四個部分進行。 第一部分 人可溶性TRAILeDNA的克隆及原核表達系統(tǒng)的構建利用基因工程技術克隆人可溶性TRAIL胞

3、外區(qū)¨4-281片段的cDNA及構建其原核表達載體pET28e㈩-sTRAIL。將pET28c(+)-sTRAIL轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)氨芐西林篩選，建立原核表達系統(tǒng)pET28c(+)sTRAIL／BL21(DE3)，該系統(tǒng)經(jīng)用1．Ommol／LIPTG誘導4h，得獲了TRAIL融合蛋白，純化并鑒定，表明，其分子量約為19．8kD。 第二部分 TRAil,對HeLa生物活性的研究 用TRAIL蛋白干預HeL

4、a，經(jīng)過MTT法檢測細胞存活分數(shù)；AO/EB熒光染色觀察凋亡細胞結構；流式細胞儀檢測細胞凋亡率等幾方面，觀察了TRAIL蛋白對HeLa的生物活性。結果，分別用5ng/m1，10ng／ml，20ng/m1，40ng/ml的TRAIL作用于HeLa24h，①細胞的存活分數(shù)為75．98％、61．94％、28．79％和26．42％；②用AO／EB染色后，可觀察凋亡細胞形態(tài)，細胞凋亡率為0％、5％、12％、28％和30％；③流式細胞儀檢測凋亡率為

5、O％、4．72％、9．91％、25．63％和32．39％；④AO／EB及流式細胞儀檢測凋亡率其結果無顯著性差異(p<0．05)。結果表明，20ng/mlTRAIL蛋白誘導HeLa24h，可有效抑制其生長并誘導其凋亡。 第三部分 TRAIL誘導HeLa凋亡的比較蛋白質(zhì)組學研究 首先，建立了HeLa蛋白質(zhì)組雙向電泳技術。用三種不同配方的裂解液提取HeLa中的蛋白質(zhì)，進行雙向凝膠電泳，建立和優(yōu)化HeLa蛋白質(zhì)組分析所需的樣品

6、處理方法和雙向電泳技術。結果，聯(lián)合使用尿素、硫脲和廣譜蛋白酶抑制劑，有利于提取全細胞蛋白質(zhì)，檢出堿性蛋白和增加2-DE分辨率，檢出的蛋白點數(shù)可達820~12。然后，利用已建立的雙向電泳技術，分離TRAIL干預與未干預的HeLa的全細胞蛋白質(zhì)，用PDQuest(7．4．0)軟件進行比較分析、尋找差異表達蛋白，差異表達蛋白再經(jīng)MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析，MS-Fit數(shù)據(jù)庫鑒定。結果：篩選了12個明顯的差異蛋白點，其中，8個蛋白點表達上

7、調(diào)，4個蛋白點表達下調(diào)。它們分別是：JNKK，MAPKAPK-2，DIPl3beta，SHPS-1，GEM-1，DDBb，Leucine-richrepeat-containingprotein14，Macoilin；GrblOadaptorprotein，Ena／VASP-likeprotein，PTPase-MEG2andTHUMPdomain-containingprotein1． 第四部分 TRAII,誘導HeLa凋亡

8、的作用機理的初步研究 分別用10ng／ml、20ng/m1和40ng/mlTRAIL干預HeLa24h后，用RT-PCR半定量方法檢測HPVl8E6基因及JNK2的mRNA表達；流式細胞儀檢測細胞周期。結果，①隨著TRAIL劑量的增加，HPVl8E6基因的表達水平下降，而JNK2基因的表達水平增加；②細胞周期呈現(xiàn)明顯的變化：G0／Gl期細胞比例逐漸減少，由62．19％降到37．69％，而G2／M期和S期細胞比例逐漸增加，分別由1