動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中糜酶活性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景 冠心病和腦卒中是嚴(yán)重危害人類健康的常見病和多發(fā)病，其病理基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化(AS)。大量證據(jù)表明，在AS的形成和發(fā)展過程中，內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞等發(fā)揮了重要的作用。晚近的研究證實(shí)肥大細(xì)胞與AS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。肥大細(xì)胞通過分泌多種炎癥介質(zhì)，包括糜酶(chymase)、組胺和各種化學(xué)因子及細(xì)胞因子，誘導(dǎo)血管炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮功能失調(diào)、泡沫細(xì)胞形成、胞外基質(zhì)降解和微血管新生等，對AS斑塊的形成及斑

2、塊穩(wěn)定性起著重要作用。其中，肥大細(xì)胞分泌的糜酶與AS病程進(jìn)展關(guān)系尤為密切。綜合研究表明，糜酶可能通過以下途徑促進(jìn)AS的形成和發(fā)展過程：(1)通過介導(dǎo)非經(jīng)典途徑激活血管組織中的腎素—血管緊張素系統(tǒng)(RAS)，引起血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)生成增加，促進(jìn)AS病變的進(jìn)展和斑塊易損；(2)通過水解活化多種炎性因子，促進(jìn)AS的炎癥反應(yīng)過程，加速AS的進(jìn)展；(3)通過降解載脂蛋白AI(Apo-AI)，阻礙泡沫細(xì)胞的膽固醇外向轉(zhuǎn)運(yùn)，引起胞內(nèi)脂質(zhì)淤積，導(dǎo)

3、致細(xì)胞壞死脂質(zhì)沉積，促進(jìn)AS斑塊的形成和發(fā)展；(4)直接蛋白水解斑塊纖維帽的基質(zhì)成分，如：連接蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白、Ⅳ型和Ⅴ型膠原，導(dǎo)致纖維帽變薄，促進(jìn)斑塊向不穩(wěn)定方向轉(zhuǎn)變；(5)通過活化基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)、MMP-2、MMP-3和MMP-9，導(dǎo)致斑塊纖維帽的基質(zhì)成分水解而影響斑塊的穩(wěn)定性；(6)通過活化多種炎性因子誘導(dǎo)斑塊血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)凋亡并抑制其分泌活性，促進(jìn)斑塊纖維帽變薄，降低斑塊穩(wěn)定性等；(7)通

4、過促進(jìn)AngⅡ及內(nèi)皮素-1(ET-1)等遞質(zhì)的分泌，增加血管病變局部的血流剪切力，促進(jìn)AS斑塊向不穩(wěn)定方向發(fā)展?？傊用冈贏S的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著極為重要的作用。 然而，目前糜酶活性的檢測方法尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。國際上較多采用組織提取物加入含AngⅠ的反應(yīng)體系，采用反相高效液相色譜技術(shù)(HPLC)檢測糜酶活性，但測量誤差較大。國內(nèi)學(xué)者采用改良的AngⅠ反應(yīng)體系，應(yīng)用三種抑制劑分別抑制糜酶以外的其它AngⅠ水解酶的活性，運(yùn)用減法原

5、則和放射免疫技術(shù)(RIA)檢測AngⅠ水解活性，用來表示糜酶和ACE活性，理論上較為合理。但是無論液相色譜技術(shù)或是放射免疫技術(shù)，由于操作過程中對血管組織進(jìn)行高速勻漿和離心等，導(dǎo)致了糜酶與ACE活性損耗，引起肥大細(xì)胞胞漿內(nèi)游離糜酶大量釋放，同時(shí)破壞了糜酶的復(fù)合體結(jié)構(gòu)，造成檢測誤差，故而影響檢測的準(zhǔn)確性。 易損斑塊破裂、急性血栓形成造成冠脈急性閉塞是急性冠脈綜合征(acutecoronarysyndrome，ACS)的主要發(fā)病機(jī)制已

6、成為共識(shí)。尋求穩(wěn)定易損斑塊的靶點(diǎn)已成為國內(nèi)外學(xué)者研究的重要方向。由于糜酶對AS的多重影響，導(dǎo)致AS斑塊纖維帽變薄、降低斑塊穩(wěn)定性而促進(jìn)斑塊向易損性方向發(fā)展。糜酶已成為斑塊向易損方向發(fā)展的關(guān)鍵因素，能否通過阻斷糜酶活性進(jìn)而促進(jìn)斑塊的穩(wěn)定性，已引起國內(nèi)外學(xué)者的重視。 由于糜酶結(jié)構(gòu)功能存在很大的物種差異性，傳統(tǒng)用于AS研究的家兔、大鼠、小鼠和豬等動(dòng)物不適用于模擬人類糜酶的研究，目前針對敘利亞倉鼠糜酶的基因敲除或沉默治療尚難以開展?，F(xiàn)階

7、段常用于抑制動(dòng)物體內(nèi)糜酶活性的藥物包括肥大細(xì)胞膜穩(wěn)定劑曲尼司特和一些特異性非肽類糜酶抑制劑(如BCEAB、SUN-C8257和NK3201)，但后者尚處于研究開發(fā)階段，相關(guān)的機(jī)制研究尚不明確，目前尚無公認(rèn)的特異性糜酶抑制劑用于科研和臨床。Jin等首先研究證實(shí)曲尼司特可以高效地抑制血管組織中糜酶活性，阻斷糜酶介導(dǎo)的AngⅡ生成。隨后的大量研究證明，曲尼司特用于抑制糜酶活性的劑量應(yīng)是常規(guī)劑量的10倍，曲尼司特可以顯著抑制血管移植及PTCA術(shù)

8、后血管糜酶活性。曲尼司特是一種過敏遞質(zhì)阻釋劑，它可抑制肥大細(xì)胞的磷酸二酯酶，穩(wěn)定細(xì)胞膜，防止細(xì)胞脫顆粒和釋放糜酶等化學(xué)遞質(zhì)，同時(shí)，還可以抑制肥大細(xì)胞增殖，使細(xì)胞停滯于G0/G1期，減少其數(shù)量，從而起到減少糜酶分泌進(jìn)而發(fā)揮穩(wěn)定斑塊的治療作用。 縱觀國內(nèi)外的研究成果，盡管目前在糜酶與AS病變的研究方面已取得了一定進(jìn)展，但在糜酶與AS的相互關(guān)系的研究領(lǐng)域中仍存在許多重大問題亟待解決： (1)目前尚缺乏適用于前瞻性研究糜酶活性增

9、高對AS病變影響的動(dòng)物模型。受糜酶結(jié)構(gòu)功能物種差異性等因素的影響，糜酶與AS的在體研究尚停留停留在回顧性研究階段，缺乏適用于前瞻性研究糜酶激活對AS病變影響的模型。(2)如何建立檢測組織糜酶活性的可靠方法?目前糜酶活性的檢測方法尚不統(tǒng)一，常用的糜酶活性HPLC和RIA檢測法存在較大的缺陷，亟待建立可靠的檢測方法。(3)能否通過在體研究激活或抑制糜酶活性對AS病變的影響，進(jìn)一步揭示血管糜酶在AS斑塊易損過程中的作用機(jī)制呢?(4)能否通過曲

10、尼司特抑制血管糜酶活性延緩AS病程的進(jìn)展，進(jìn)而增加斑塊的穩(wěn)定性，為糜酶作為治療靶點(diǎn)提供充分的理論依據(jù)? 以上問題構(gòu)成本課題的設(shè)計(jì)思路和研究目的。 方法 1.AS斑塊糜酶活性的方法學(xué)研究 (1)AS模型的建立：120只8周齡雄性金黃敘利亞倉鼠，隨機(jī)分成正常對照組(A組)15只，AS斑塊組(B1組～B7組)每組15只共105只。A組采用普通飼料喂養(yǎng)，B1～B7組采用高脂飼料(0.5﹪膽固醇+10﹪豬油+89.

11、5﹪基礎(chǔ)飼料，每只12～15g.d-1)喂養(yǎng)12周。第12周末行血流動(dòng)力學(xué)檢測，并在A組隨機(jī)處死1只倉鼠，檢驗(yàn)腹主動(dòng)脈無AS斑塊形成；在B1～B7組每組隨機(jī)處死1只倉鼠，驗(yàn)證腹主動(dòng)脈產(chǎn)生動(dòng)脈粥樣硬化病變。 (2)抗原致敏：第13周初進(jìn)行抗原致敏，取1ml卵白蛋白懸浮液(10﹪卵白蛋白+3﹪氫氧化鋁)對B2～B7組倉鼠雙側(cè)腋下及腹股溝皮下各注射0.15ml，腹腔注射0.4ml，聯(lián)合腹腔注射百日咳白喉破傷風(fēng)三聯(lián)疫苗2ml(約含101

12、0百日咳菌株)，誘發(fā)倉鼠體內(nèi)發(fā)生Ⅰ型超敏反應(yīng)，產(chǎn)生IgE抗體，與肥大細(xì)胞特異性結(jié)合，致敏肥大細(xì)胞。對A組和B1組倉鼠注射等量生理鹽水假致敏，分別作為正常對照和高脂對照。 (3)抗原激發(fā)：第15周末，每組抽取半數(shù)倉鼠作為激發(fā)(假激發(fā))術(shù)前的自身對照，然后對B3～B7組剩余的半數(shù)倉鼠進(jìn)行腹主動(dòng)脈局部封閉注射卵白蛋白，誘導(dǎo)糜酶釋放：在髂總動(dòng)脈以上的約2cm的腹主動(dòng)脈段兩端結(jié)扎暫時(shí)阻斷血流10分鐘，于近心端沿動(dòng)脈血流方向分別注射0.5﹪

13、、1﹪、2.5﹪、5﹪和10﹪的卵白蛋白懸浮液0.2ml(分別含1mg、2mg、5mg、10mg和20mg卵白蛋白)，激活血管組織中致敏的肥大細(xì)胞大量釋放糜酶。對假致敏的A組、B1組和致敏的B2組倉鼠實(shí)施假激發(fā)術(shù)(注射生理鹽水)。術(shù)后48小時(shí)處死剩余倉鼠。 2.AS斑塊糜酶活性的干預(yù)性研究 (1)AS模型：60只8周齡雄性金黃敘利亞倉鼠，隨機(jī)分成正常對照組(A組)15只，AS斑塊組(B1組～B3組)每組15只

14、共45只。A組采用普通飼料喂養(yǎng)，B1組～B3組采用高脂飼料喂養(yǎng)12周，每周末監(jiān)測體重。第12周術(shù)在A組隨機(jī)處死1只倉鼠，檢驗(yàn)腹主動(dòng)脈無AS斑塊形成；在B1組～B3組每組隨機(jī)處死1只倉鼠，驗(yàn)證腹主動(dòng)脈產(chǎn)生動(dòng)脈粥樣硬化病變。 (2)糜酶活性干預(yù)：從第13周開始，對實(shí)驗(yàn)倉鼠進(jìn)行以下干預(yù)：對B2組倉鼠注射卵白蛋白懸液及三聯(lián)疫苗致敏其體內(nèi)肥大細(xì)胞(同方法學(xué)研究)，每日給予蒸餾水灌胃，致敏3周后處死半數(shù)做激發(fā)術(shù)前自身對照，對剩余的倉鼠進(jìn)行腹

15、主動(dòng)脈局部封閉注射5mg卵白蛋白進(jìn)行抗原激發(fā)(通過方法學(xué)研究所確定的劑量)，作為糜酶激活組；對B3組倉鼠注射安慰劑假致敏，每日給予肥大細(xì)胞活性抑制劑曲尼司特400mg/kg灌胃，3周后每組處死半數(shù)做假激發(fā)術(shù)前自身對照，對剩余倉鼠注射安慰劑實(shí)施假激活術(shù)，作為曲尼司特治療組；對A組和B1組倉鼠注射安慰劑(生理鹽水)假致敏，每日給予蒸餾水灌胃，3周后每組處死半數(shù)做假激發(fā)術(shù)前自身對照，對剩余倉鼠注射安慰劑實(shí)施假激活術(shù)，分別作為正常對照和高脂對照

16、。術(shù)后48小時(shí)處死各組剩余倉鼠。根據(jù)方法學(xué)研究所確定的血管體外灌流技術(shù)觀察血管的糜酶與ACE活性變化。 結(jié)論 1.本研究通過對卵白蛋白抗原預(yù)致敏的AS倉鼠實(shí)施局部血管段抗原攻擊的方法，有效地激活了該段AS血管的糜酶活性，成功地建立了適用于前瞻性觀察糜酶活性對AS病變影響的動(dòng)物模型。 2.血管灌流技術(shù)克服了以往研究對細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞的不足，具有保護(hù)組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能完整性的優(yōu)點(diǎn)，是研究糜酶活性較為理想的方法學(xué)。