枸櫞酸西地那非對(duì)小鼠聽力影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、枸櫞酸西地那非( Sildenafil citrate)是特異的5型磷酸二酯酶(type5 phosphosdesterase, PDE5)磷酸二酯酶抑制劑,起先研發(fā)該類藥物,目的用于治療心血管方面疾病,而后發(fā)現(xiàn)在治療勃起功能障礙(erectile dysfunction,ED)方面有顯著效果。近年來隨著枸櫞酸西地那非被廣泛使用,其藥物副作用報(bào)道也增多,2007年美國FDA根據(jù)數(shù)十例臨床案例的調(diào)查結(jié)果,首次報(bào)道該類藥可導(dǎo)致藥物性聽力下降

2、。為了研究這一問題,許多研究者進(jìn)行了臨床流行病學(xué)調(diào)查,顯示5型磷酸二酯酶抑制劑類藥物與聽力突然喪失有著重要關(guān)聯(lián)性,其中枸櫞酸西地那非發(fā)病率最高,大劑量使用發(fā)病率則高達(dá)50％。由于用藥不慎而致中毒性耳聾會(huì)給患者增加更多痛苦,因此,重視該類藥物的耳毒性,研究這類藥物耳毒性的發(fā)病機(jī)制具有重要價(jià)值,這可以指導(dǎo)臨床醫(yī)生正確使用該類藥物。目前國內(nèi)外對(duì)該類藥物耳毒性的研究主要以回顧性病例分析總結(jié)為主,缺乏有效動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。
　　本課題擬通過動(dòng)物

3、實(shí)驗(yàn),研究枸櫞酸西地那非對(duì)小鼠聽力的影響,建立昆明小鼠在體枸櫞酸西地那非耳毒性模型,并探討該藥對(duì)聽力損傷的可能機(jī)制,包括該藥對(duì)耳蝸毛細(xì)胞形態(tài)、毛細(xì)胞離子通道和電生理特性的影響。為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)證據(jù),指導(dǎo)臨床正確使用該類藥物。
　　研究目的:
　　1.通過灌胃給藥,觀察枸櫞酸西地那非對(duì)小鼠聽力的影響;
　　2.應(yīng)用全細(xì)胞電流鉗和細(xì)胞貼附電壓鉗技術(shù),觀察枸櫞酸西地那非對(duì)小鼠耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞電生理的影響,探討其耳毒性機(jī)制。

4、r>　　材料和方法:
　　1.選擇健康7周齡雄性昆明小鼠40只,隨機(jī)分為4組,分別為枸櫞酸西地那非低劑量組(0.1mg/(kg·d)、中劑量組(1 mg/(kg·d)、高劑量組(10 mg/(kg·d))、空白對(duì)照組,檢測(cè)每組于灌胃給藥第0、1、5、10、20天的聽性腦干反應(yīng)閾值(Auditory brain-stem response,ABR),研究枸櫞酸西地那非對(duì)小鼠聽力的影響;采用異硫氰基熒光素(fluorescein is

5、othiocyanate,FITC)標(biāo)記的免疫熒光染色方法觀察昆明小鼠耳蝸毛細(xì)胞的形態(tài)改變;并用高效液相色譜分析法(High performance liquid chromatography, HPLC)檢測(cè)小鼠耳蝸內(nèi)淋巴液枸櫞酸西地那非濃度。
　　2.枸櫞酸西地那非對(duì)小鼠耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞電生理影響的檢測(cè):分組如下:A組:正常組;B組:枸櫞酸西地那非低劑量組。應(yīng)用全細(xì)胞電流鉗和細(xì)胞貼附電壓鉗技術(shù),檢測(cè)正常組和枸櫞酸西地那非低劑量組內(nèi)

6、毛細(xì)胞(inner hair cell,IHC)的鈣電流和膜電容的變化。
　　結(jié)果:
　　1. ABR的閾值結(jié)果顯示:正常對(duì)照組20天內(nèi)ABR閾值的波動(dòng)較小,無明顯變化;給藥后1天,各組ABR閾值較正常對(duì)照組和喂藥前無明顯差異(未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P>0.05);5天后西地那非給藥組閾值則逐漸提高。西地那非各劑量組與空白對(duì)照組比較均有不同程度的聽覺損傷,表現(xiàn)為ABR閾值上移,閾值上移程度與給藥劑量有關(guān),高劑量組較為明顯,西地那

7、非低劑量組較輕;各組隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng),閾移逐漸增大。FITC熒光染色結(jié)果顯示:綠色熒光為小鼠耳蝸毛細(xì)胞胞體,正常對(duì)照組小鼠耳蝸毛細(xì)胞即外毛細(xì)胞(outer hair cell,OHC)和內(nèi)毛細(xì)胞(inner hair cell,IHC)形態(tài)正常,排列整齊,著色均勻、無缺失。西地那非低劑量組耳蝸損傷相對(duì)較輕,內(nèi)、外毛細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常。西地那非中劑量組內(nèi)毛細(xì)胞損傷較輕,3排外毛細(xì)胞損傷明顯。西地那非高劑量組內(nèi)、外毛細(xì)胞出現(xiàn)排列紊亂,細(xì)胞

8、缺失,結(jié)構(gòu)不完整,尤其是外毛細(xì)胞排列紊亂,甚至全部缺失。HPLC檢測(cè)耳蝸內(nèi)淋巴液結(jié)果顯示:灌服一定劑量的枸櫞酸西地那非后,能在小鼠耳蝸內(nèi)淋巴液中檢測(cè)到枸櫞酸西地那非,出峰時(shí)間約在5.2min,且給藥劑量增加,波峰增高,說明耳蝸內(nèi)淋巴液中西地那非積聚濃度與給藥劑量相關(guān)。
　　2.應(yīng)用全細(xì)胞式膜片技術(shù)分別檢測(cè)正常組和枸櫞酸西地那非低劑量組耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞的鈣電流和細(xì)胞膜電容,所得數(shù)據(jù)做兩樣本t檢驗(yàn)。結(jié)果顯示:所檢測(cè)的鈣電流為內(nèi)向電流,且成

9、電壓依賴性的激活。與正常組相比,枸櫞酸西地那非使耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞鈣電流內(nèi)流減少,(P<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義),同時(shí)該藥使內(nèi)毛細(xì)胞的膜電容增量降低(P<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。
　　結(jié)論:
　　1.枸櫞酸西地那非可吸收入血液并能夠通過血迷路屏障進(jìn)入內(nèi)耳,在內(nèi)耳積聚;服用一定劑量的枸櫞酸西地那非可以造成小鼠聽力損傷。
　　2.枸櫞酸西地那非可以造成耳蝸毛細(xì)胞的損傷,其損傷程度與使用劑量及時(shí)間有關(guān)。
　　3.枸