禾谷絲核菌（Rhizoctonia cerealis）對(duì)戊唑醇的抗性機(jī)制研究.pdf

1、本研究以野生敏感型禾谷絲核菌(Rhizoctoniacerealis)菌株(WW)為材料，經(jīng)藥劑篩選和UV誘導(dǎo)，分別獲得了抗戊唑醇(Tebuconazole)禾谷絲核菌菌株(WX1、WX2和WWL)。戊唑醇對(duì)3個(gè)菌株的EC50值由0.0120μg/mL分別增加到0.1226μg/mL、0.2585μg/mL和0.4004μg/mL，抗性分別為10.2倍、21.5倍33.4倍。 以獲得的抗性菌株和敏感菌株為材料，采用菌落直徑法和菌

2、絲干重法研究了查彼克(Czapek)培養(yǎng)基中不同營養(yǎng)源、pH值和溫度對(duì)抗性和敏感菌株生長的影響，以探明抗性菌株和敏感菌株之間生理適合度的差異。發(fā)現(xiàn)在不同碳源條件下，所有菌株都在蔗糖、甘油和葡萄糖中生長最快，在木糖和果糖中生長相對(duì)較慢；在相同碳源條件下，高抗菌株(WWL)的生長速度小于敏感菌株(WW)和中抗菌株(WX1和WX2)，WX1、WX2和WW之間的生長速度差異不明顯。在不同氮源條件下，所試菌株均能較好利用硝酸鹽、亞硝酸鹽、精氨酸和

3、丙氨酸，不能充分利用胱氨酸；在同一氮源條件下，WWL的生長速度小于WW、WX1和WX2，而WX1、WX2和WW之間差異不明顯。所有供試菌株在pH值6、7、11、12時(shí)生長均較快，在pH值為4和10時(shí)生長最慢；當(dāng)pH值為4時(shí)，WWL的菌落直徑要明顯大于WX1、WX2和WW；當(dāng)pH為5、11和12時(shí)，WWL的菌落直徑要明顯小于其它菌株，pH值為6、7、8、9和10時(shí)，各菌株間菌落直徑差異不明顯。所有菌株均是在20和25℃時(shí)生長速度最快，在1

4、0和30℃時(shí)生長最慢，基本不能生長。在相同的溫度條件下，WWL的菌落直徑要相對(duì)高于WX1、WX2和WW，但WX1、WX2和WW之間的菌落直徑差異不明顯。 不同濃度戊唑醇處理抗性與敏感菌株后，體內(nèi)過氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性與抗藥性呈一定的相關(guān)性。用戊唑醇處理所有菌株，24h內(nèi)所有菌株的POD活性不斷升高，抗性菌株的POD活性明顯高于敏感菌株，其中WWL的活性最高；至24h，用25mg/L戊唑醇處理后WWL

5、、WX2、WX1和WW的POD活性分別為44.16、30.64、20.56和17.44u/g·min，均達(dá)最高值。PAL活性表現(xiàn)出先迅速上升又迅速下降的趨勢，以25mg/L處理1.5h時(shí)WWL活性最高，達(dá)7020u/g·h；WX2、WX1和WW的PAL活性值也分別為6375、5800和5370u/g·h；此后所有處理的PAL活性隨著時(shí)間迅速下降，至24h時(shí)達(dá)到最低值，各菌株活性大小排列依次為WWL＞W(wǎng)X2＞W(wǎng)X1＞W(wǎng)W。酯酶同工酶和可溶

6、性蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗性菌株和敏感菌株無論在譜帶數(shù)上還是量上都存在明顯的差異。 在相同的滲透壓環(huán)境下，敏感菌株對(duì)滲透壓較抗性菌株更為敏感。在高滲環(huán)境下不同抗性水平菌株間滲透壓的敏感性有一定的差異，但在中滲環(huán)境下不同抗性水平菌株的敏感性差異不大；敏感菌株只對(duì)低滲透壓和高滲透壓相對(duì)較為敏感。當(dāng)用不同濃度的戊唑醇處理后，抗性菌株能在較短的時(shí)間里(1h)滲出更多的電解質(zhì)；但最終敏感菌株的相對(duì)滲率要明顯高于抗性菌株。用高濃

7、度和低濃度的戊唑醇分別處理抗性菌株后，前者的相對(duì)滲率明顯高于后者。 采用反相高效液相色譜法(HPLC)，建立了檢測禾谷絲核菌菌絲吸收戊唑醇的方法。比較了用戊唑醇處理后，敏感和不同抗性水平菌株對(duì)戊唑醇的吸收及藥劑在菌體內(nèi)的積累差異。在0.5mg/L劑量處理下，處理后24.0h，敏感菌株體內(nèi)戊唑醇的濃度比高抗菌株高127.74％，比兩個(gè)中抗菌株分別高47.72％和7.83％。因戊唑醇在抗性菌株體內(nèi)的積累濃度明顯低于敏感菌株，降低了藥

8、劑對(duì)菌體的實(shí)際作用濃度，從而表現(xiàn)出抗藥性提高。 采用反相高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行定量測定，比較了藥劑處理后抗性與敏感菌株體內(nèi)麥角甾醇和羊毛甾醇的含量變化。在正常條件下，所有菌株體內(nèi)的兩種甾醇含量無明顯差異；當(dāng)用戊唑醇處理后，所有菌株體內(nèi)的麥角甾醇含量都明顯下降，羊毛甾醇含量明顯上升，且濃度越高越明顯；當(dāng)用高濃度的戊唑醇(0.25mg/L)處理后，WW體內(nèi)的羊毛甾醇含量最高，達(dá)116.38μg/g菌絲鮮重；WWL的最低，僅為

9、30.53μg/g菌絲鮮重；WX1和WX2的分別為36.47和30.53μg/g菌絲鮮重；麥角甾醇以WWL的含量最高，為231.28μg/g菌絲鮮重；WW、WX1和WX2的含量僅分別為57.97、157.72和144.78μg/g菌絲鮮重，分別是WWL的25.06％、68.19％和62.60％。 根據(jù)對(duì)已發(fā)表的絲狀真菌的CYP51基因序列的保守區(qū)域，設(shè)計(jì)了一對(duì)簡并引物，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)成功克隆到了WW、WX1、WWL

10、的CYP51基因片斷，將RWWCYP51片斷與其它絲狀真菌比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，同源性為41.86％～52.0％，大于40％，屬于P450家族。將3個(gè)菌株的核苷酸序列(RWWCYP51，RWX1CYP51，RWWLCYP51)進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，敏感菌株與中抗菌株和高抗菌株的片斷序列在8、593、670、673位的核苷酸分別由T、A、T、A變?yōu)镃、G、C、T，而高抗菌株和敏感、中抗菌株之間在核苷酸上有數(shù)十個(gè)堿基存在明顯不同，且不是連續(xù)的。 由于