禾谷絲核菌(Rhizoctonia cerealis)rDNA-ITS序列異質(zhì)性分析.pdf

1、小麥紋枯病又稱小麥尖眼點病(Wheat sharp eyespot)，是分布地域廣泛的土傳性真菌病害，幾乎遍及世界各溫帶小麥種植地，且危害范圍呈逐年擴大的趨勢。小麥紋枯病的病原為禾谷絲核菌（Rhizoctonia cerealis）,該菌在自然和人工條件下都難以產(chǎn)生無性或有性態(tài)的孢子，且細胞核為同質(zhì)核還是異質(zhì)核，目前尚無定論。這都嚴重制約著該病菌的分子遺傳學和相關致病機制的研究。禾谷絲核菌的rDNA-ITS異質(zhì)性雖有報道，但對其異質(zhì)性規(guī)

2、律及原因尚未詳細探討。本研究利用三株地理來源不同的禾谷絲核菌為供試材料，采用原生質(zhì)體制備技術，獲得原生質(zhì)體再生菌落(single-protoplast isolate, SPI），對多個再生菌落的ITS區(qū)進行測序，利用相關生物信息學軟件對ITS多序列進行比對分析，尋找禾谷絲核菌ITS序列多態(tài)性的變化規(guī)律，并探究ITS序列多態(tài)性是否與R. cerealis細胞核異質(zhì)性有關。主要研究結果如下：
　　1．通過原生質(zhì)體制備技術，成功獲得供

3、試菌株WK-207、WK-137、WK-159的多個SPIs，分別為42、8、4。利用PDA培養(yǎng)基分別對不同的SPIs進行25℃恒溫培養(yǎng)，并利用4',6'二氨基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylidole，DAPI)，進行細胞核熒光染色，觀察核相。結果顯示，SPIs與原始菌株在菌落形態(tài)、菌絲形態(tài)以及核相等方面均無差異。
　　2．本研究從來自3個原始菌株的54個SPIs菌株中共獲得169條ITS序列，其中

4、WK-207菌株共獲得89條，WK-137菌株共獲得50條，WK-159菌株共獲得30條。分析結果表明，來自三株不同菌株的SPIs的ITS序列在長度、GC含量以及單核苷酸多態(tài)位點（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）的位置及類型上均存在差異；對來自同一菌株的SPIs的ITS序列進行分析，發(fā)現(xiàn)這種差異既發(fā)生在同一菌株的不同SPIs菌株間，也存在于同一SPIs的不同ITS序列拷貝之間。
　　3．對IT

5、S多序列比對發(fā)現(xiàn)，ITS1區(qū)與ITS2區(qū)存在不同的變異速率。在禾谷絲核菌WK-207、WK-137、WK-159中，ITS2區(qū)存在的單核苷酸多態(tài)位點數(shù)量普遍多于ITS1區(qū)，即ITS2區(qū)變異頻率大于ITS1區(qū)；相較于ITS2區(qū)，ITS1區(qū)卻更容易發(fā)生堿基的插入或缺失，即片段長度多態(tài)性；就堿基變異類型而言，堿基轉換的頻率明顯高于堿基顛換的頻率。
　　4．為進一步探究ITS區(qū)序列的多態(tài)性與禾谷絲核菌細胞核異質(zhì)性的關系，本研究以WK-20

6、7所得的89個ITS序列進行比對分析，結果發(fā)現(xiàn)89條ITS序列絕大部分聚集于系統(tǒng)進化樹兩端，且遺傳距離相對較遠，被明顯分為兩組。因此，ITS區(qū)序列的異質(zhì)性可能與禾谷絲核菌細胞核的異質(zhì)性存在相關性。
　　5．利用DNAMAN8.對ITS序列進行一致性分析，結果發(fā)現(xiàn)三個供試菌株的ITS區(qū)序列相似性均高達99％以上。依據(jù) rDNA-ITS序列構建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹，結果表明169條ITS序列均聚集于AG-DI融合

7、群分支，與其它雙核絲核菌的融合群存在較遠的遺傳距離。因此，雖然禾谷絲核菌的ITS序列存在異質(zhì)性，但依然具有較高的一致性，而且不影響利用ITS序列進行絲核菌的融合群鑒定，甚至在區(qū)分融合亞群方面， ITS序列依然具有較高的準確度。
　　本研究利用原生質(zhì)體制備技術分析了禾谷絲核菌ITS區(qū)序列的異質(zhì)現(xiàn)象，不同菌株其多態(tài)性變化的位點不同，同一菌株其多態(tài)性位點的變化也具有一定的規(guī)律性，同一菌株ITS區(qū)序列的變化與禾谷絲核菌細胞核的異質(zhì)性有明顯