不同濃度抗磷脂抗體及TNF-α對內皮細胞分泌e-選擇素、IL-6、IL-8、MCP-1的影響.pdf

1、抗磷脂綜合征(APS)是一種系統(tǒng)性自身免疫性疾病，血清抗磷脂抗體(aPL)陽性和血栓前狀態(tài)為APS的兩大重要血清學特征，這種血清學特征與栓塞的發(fā)生和病理妊娠密切相關。APS發(fā)病機制不明，血栓形成一直以來被認為是APS發(fā)病的重要因素，而內皮細胞活化則是血栓形成的重要原因。抗體濃度及感染與APS的發(fā)病及預后關系密切，國內外學者普遍認為中高濃度情況下，濃度越高、病情越重、預后越差，感染則可加重APS病情。導致此種現(xiàn)象的機制未明，內皮細胞是否參

2、與其中，國內未見此方面研究。
　　aPL活化內皮細胞具有特定的信號傳導通路，并非簡單的磷脂結合途徑。大部分aPL直接與β2糖蛋白(I)(β2GPI)結合，aPL/β2GPI復合物進一步結合于細胞表面。目前細胞的Toll樣受體(TLR)信號傳導通路尤其是TLR2和TLR4信號通路是研究的熱點，國外研究發(fā)現(xiàn)TLR2參與aPL活化內皮細胞的信號傳導中，而TLR4是否參與其中存在爭議，國內未見相關研究。
　　內皮細胞活化后可分泌多種

3、細胞因子，本文選擇E-選擇素(SELE)、單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)、白細胞介素6（IL-6）和白細胞介素8(IL-8)四種常用且敏感的指標用以監(jiān)測內皮細胞活化后的分泌功能，其中E-選擇素mRNA表達量增加或降低時，其蛋白的表達水平發(fā)生相應的上調或下調，因此本文分別從mRNA及蛋白水平對E-選擇素的表達進行檢測，若二者的表達均增加或減少，則從一方面說明了實驗結果正確性。本文所采用的aPL為從APS患者血清中提純的IgG，為排除正常

4、IgG對實驗的影響，選擇正常人群血清中提純的IgG作為正常對照。
　　本文擬分為三個部分，第一部分體外培養(yǎng)臍靜脈內皮細胞（HUVEC），分別用正常對照IgG及不同濃度APS患者IgG刺激細胞，探討不同濃度aPL對內皮細胞分泌E-選擇素、IL-6、IL-8、MCP-1的影響。第二部分探討TNF-α干預下內皮細胞TLR2/4表達情況其TNF-α干預下aPL對血管內皮細胞分泌E-選擇素、IL-6、IL-8、MCP-1的影響，進一步研究A

5、PS血管內皮細胞活化的機制，并為治療APS提供新靶點。第三部分通過研究卡介菌多糖核酸(BCG-PSN)對aPL刺激內皮細胞分泌E-選擇素、IL-6、IL-8、MCP-1的影響，探討B(tài)CG-PSN是否有可能成為治療APS的新選擇藥物。
　　第一章不同濃度抗磷脂抗體對內皮細胞分泌E-選擇素、IL-6、IL-8、MCP-1影響的研究
　　目的:觀察不同濃度抗磷脂抗體對血管內皮細胞分泌功能的影響。
　　方法:體外培養(yǎng)人臍靜脈內

6、皮細胞，分別用PBS（空白組）、正常人血清提取的IgG（正常對照組）和不同濃度APS患者血清提取的IgG(APS IgG)（5％、10％和20％）干預細胞。采用實時熒光定量PCR及流式細胞學技術，檢測細胞E-選擇素的表達，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定細胞分泌MCP-1、IL-6和IL-8的表達，采用Western blot檢測內皮細胞TLR2和TLR4的表達。
　　結果:正常對照組內皮細胞SELE、MCP-1、IL-6和IL-8表達量

7、與空白組比較，無統(tǒng)計學差異; APS IgG可誘導內皮細胞SELE、MCP-1、IL-6和IL-8表達增加，與空白組、正常對照組比較及不同濃度APS IgG組之間兩兩比較，差異有顯著統(tǒng)計學意義;空白組、正常對照組及5％ APS IgG組兩兩比較，內皮細胞TLR2表達量無明顯差異，10％及20％ APS IgG組TLR2表達量與空白組及正常對照組比較及兩組之間比較，差異有統(tǒng)計學意義;各組之間TLR4表達量無明顯差異。
　　結論:抗磷

8、脂抗體刺激內皮細胞分泌E-選擇素、IL-6、IL-8、MCP-1增加且作用具有濃度依賴性，濃度越高，作用越強。
　　第二章 TNF-α對內皮細胞TLR2/4表達的影響及APS發(fā)病機制的研究
　　目的:探討TNF-α干預下aPL刺激內皮細胞分泌E-選擇素、IL-6、IL-8、MCP-1的情況及TLR2和TLR4在抗磷脂抗體刺激內皮細胞分泌E-選擇素、IL-6、IL-8、MCP-1中的作用。
　　方法:
　　(1)一

9、半細胞采用腫瘤壞死因子α（TNF-α）預刺激24小時后去除刺激因素8小時，一半細胞未經(jīng)TNF-α預刺激但余處理相同，收集一部分TNF-α預刺激及未預刺激細胞，采用Western blot檢測TNF-α預處理對內皮細胞TLR2和TLR4表達的影響，余下的TNF-α預刺激及未預刺激細胞分別用脂磷壁酸(LTA)、正常對照IgG及不同濃度APS IgG（5％、10％和20％）進行干預，采用實時熒光定量PCR及流式細胞學技術，檢測細胞E-選擇素的

10、表達，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定細胞分泌MCP-1、IL-6和IL-8的表達;
　　(2)分別加入抗-TLR2或（和）抗-TLR4阻斷抗體阻斷TLR2或（和）TLR4信號傳導通路后，用20％濃度APS IgG干預細胞，采用實時熒光定量PCR及流式細胞學技術，檢測細胞E-選擇素的表達，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定細胞分泌MCP-1、IL-6和IL-8的表達。
　　結果:經(jīng)TNF-α預刺激后，細胞TLR2表達量較未經(jīng)TNF-α預刺激細

11、胞明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義，TLR4表達量無明顯變化;經(jīng)TNF-α預處理及未預處理細胞均用TLR2特異性激動劑LTA進行干預，經(jīng)TNF-α預處理組SELE、MCP-1、IL-6和IL-8表達量較未經(jīng)TNF-α預處理組明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義;經(jīng)TNF-α預刺激后再用同濃度APS IgG干預細胞，SELE、MCP-1、IL-6和IL-8表達量與僅用APS IgG干預組比較明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義，不同濃度APS IgG組與正常對照組

12、四組之間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義;抗-TLR2+APS IgG組及抗-TLR2+抗-TLR4組內皮細胞SELE、MCP-1、IL-6和IL-8表達量，較APS IgG組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義;抗-TIR4+ APS IgG組內皮細胞SELE、MCP-1、IL-6和IL-8表達量，與APS IgG組比較無明顯改變，差異無統(tǒng)計學意義。
　　結論:
　　(1)TNF-α干預下抗磷脂抗體刺激內皮細胞分泌E-選擇素、IL-6、

13、IL-8、MCP-1的作用增強。
　　(2)抗磷脂抗體通過TLR2信號傳導通路刺激內皮細胞使其E-選擇素、IL-6、IL-8、MCP-1分泌增加。
　　第三章卡介菌多糖核酸對抗磷脂抗體刺激內皮細胞分泌E-選擇素、IL-6、IL-8、MCP-1的影響
　　目的:探討卡介菌多糖核酸(BCG-PSN)干預下抗磷脂抗體刺激內皮細胞分泌E-選擇素、IL-6、IL-8、MCP-1的情況。
　　方法:用APS患者血清提取的Ig

14、G處理內皮細胞，APS IgG處理前預先加入不同濃度BCG-PSN（0、25、50和100μg/ml），采用實時熒光定量PCR及流式細胞學技術，檢測細胞E-選擇素表達，采用ELISA測定細胞分泌MCP-1、IL-6和IL-8的表達。
　　結果:BCG-PSN干預下APS IgG所誘導的內皮細胞SELE、MCP-1、IL-6和IL-8表達明顯降低，APS IgG組及不同濃度BCG-PSN組之間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義。