新西蘭兔異體靜脈間置移植模型的建立和4℃UW液保存異體血管的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景： 自上世紀(jì)初人們便開始了對器官移植的漫長探索，20世紀(jì)50年代血管吻合技術(shù)的成熟和80年代高效免疫抑制劑的迅速發(fā)展才使器官移植學(xué)科異軍突起，迄今為止，心臟、肝臟、腎臟等重要實(shí)體臟器的臨床移植治療已經(jīng)形成了完善的學(xué)科體系。 實(shí)體器官移植最關(guān)鍵的手術(shù)步驟在于將被移植器官的血管系統(tǒng)重建。肝臟具有復(fù)雜的肝動脈、門靜脈和肝靜脈系統(tǒng)，它們的正常解剖結(jié)構(gòu)對肝臟功能都是不可缺少的。無論是尸體肝移植還是活體肝移植，肝動脈、門靜脈

2、和肝靜脈的重建過程均是肝移植手術(shù)成敗與否的關(guān)鍵。肝血管在重建的過程中，可能會出現(xiàn)供受體血管不匹配、血管變異以及血管病變等情況，就需要利用血管替代物進(jìn)行血管整形來完成血流重建；其它臨床領(lǐng)域，如外周血管和冠狀血管阻塞性疾病的外科治療也會使用血管替代物重建堵塞血管。隨著近年來血管外科和器官移植外科的發(fā)展，在過去的20年內(nèi)臨床上對血管替代物的需求越來越多。這些血管替代物可分為3類：自體血管，異體血管和人工血管。自體血管由于獲取受限，應(yīng)用范圍狹窄

3、；人造血管則因造價昂貴及可能導(dǎo)致致死性感染并發(fā)癥，難以普及推廣；而異體血管可隨器官供體大量獲取，組織保存技術(shù)的進(jìn)步也促使血管庫的不斷完善，因此，近20年以來人們對直徑小于6mm血管移植更多的使用了異體血管。 異體血管現(xiàn)有的保存方法有深低溫凍存(-150℃或-196℃)、低溫冷保存法(0-4℃)和戊二醛保存[4]。深低溫凍存需要特定的保存液、抗凍劑和昂貴的深低溫設(shè)備，凍存血管升、降溫速率必須控制在一定范圍內(nèi)，速率過快會造成組織碎裂

4、和細(xì)胞死亡，這樣的降溫、復(fù)溫必然耗時漫長，操作繁瑣。但是其保存、解凍和操作流程已經(jīng)形成了規(guī)范，是目前血管組織庫保存血管的標(biāo)準(zhǔn)方法。而所有臨床應(yīng)用戊二醛保存方法的均是針對以入臍靜脈(human umbilical vein，HUV)為研究目的的復(fù)合血管，臍靜脈經(jīng)戊二醛酸化處理后在血管外覆蓋一層Dacron網(wǎng)狀物并長時間保存在50％酒精中，在絕大多數(shù)的相關(guān)文獻(xiàn)中并沒有對戊二醛保存的方法進(jìn)行詳細(xì)描述。這兩種保存方法的效果十分良好，然而在器官移

5、植外科由于存在供體血管變異的不可預(yù)知性和術(shù)中情況的復(fù)雜性，針對血管替代物的需求也是難以預(yù)知和非常迫切的。對于有大量和穩(wěn)定來源的尸體異體血管，我們僅僅需要在短期內(nèi)有效保存它們便可以完全滿足移植外科對血管替代物的需要，那么建立一個成本低廉、操作簡便的臨時血管庫將十分具有應(yīng)用價值，0-4℃條件下的冷保存方法具備了以上要求。冷保存的保存液大致分為鹽溶液和營養(yǎng)液兩種，在目前的臨床應(yīng)用中異體血管冷保存均是采用鹽溶液，文獻(xiàn)報道有效保存時間可長達(dá)10-

6、21天。UW液作為實(shí)體器官保存液，特別是肝臟，集成了鹽溶液和營養(yǎng)液的優(yōu)勢，對一般實(shí)體臟器的細(xì)胞保存效果良好。但是對血管組織和內(nèi)皮細(xì)胞保存效果的系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)研究尚未見文獻(xiàn)報道。 基于以上研究背景，我們設(shè)計(jì)了以UW液為保存媒介的異體血管冷保存方法的動物實(shí)驗(yàn)和臨床研究。本課題立足臨床應(yīng)用，存新西蘭兔上建立異體靜脈移植模型，并觀察UW液保存組和鹽溶液保存組的移植物效果對比，對離體保存的異體血管，通過伊文思藍(lán)染色、細(xì)胞增殖反應(yīng)實(shí)驗(yàn)和Weste

7、rn blot等方法觀察經(jīng)兩種保存液保存后的血管內(nèi)皮細(xì)胞完整性、增殖能力和功能性蛋白表達(dá)。臨床上通過觀察活體肝移植患者采用改良方法保存的異體靜脈完成肝靜脈分支重建的術(shù)后不同時間血管移植物通暢率來評估Uw液保存異體血管的臨床應(yīng)用價值。本課題旨在探討UW液在低溫冷保存異體血管中的優(yōu)勢和對血管組織的保護(hù)效能，為臨床使用UW液冷保存的異體血管和建立簡易血管庫提供新方法和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 一、新西蘭免異體靜脈間置移植模型的建立 目的：

8、 1．探討新西蘭兔靜脈間置血管移植模型的建立技巧及方法： 2．比較不同創(chuàng)立方法間的優(yōu)缺點(diǎn)。 方法： 選取體重在3.5-4.5公斤的雄性新西蘭兔作為受試對象。分別選取受試動物的頸靜脈(內(nèi)徑約4mm)和下腔靜脈(內(nèi)徑約6mm)作為血管吻合部位，使用兔的同種異體下腔靜脈血管條段(長約7-10mm)作為間置血管進(jìn)行靜脈端．端吻合來完成動物模型，比較兩種方法在手術(shù)時間、血管阻斷時間、動物存活率以及血管移植物通暢率上的

9、差異。 結(jié)論： 采用新西蘭兔頸靜脈和下腔靜脈部位進(jìn)行靜脈移植物的血管端。端吻合方法均是簡單、易行和安全的異體靜脈移植動物模型，兩種方法各具優(yōu)點(diǎn)，對動物存活率、移植血管通暢率等方面無顯著影響，均是可以檢驗(yàn)血管保存效果的理想模犁。 二、不同保存方法和不同保存時間的異體靜脈移植物在動物體內(nèi)的效果觀察 目的： 1．通過新西蘭兔頸靜脈部位的異體靜脈移植模型來探討UW液和鹽溶液兩種冷保存方法的保存效果；

10、 2．探討使用UW液冷保存法是否優(yōu)于鹽溶液冷保存法。 方法： 1．獲取新西蘭兔的下腔靜脈條段作為待移植的異體血管，分別用UW液和PBS液在4℃條件下冷保存1周、2周、3周及4周； 2．存新西蘭兔左側(cè)頸靜脈上移植入PBS液保存的異體靜脈，而在右側(cè)植入UW液保存相同時間的異體靜脈，每一個保存時間段各完成15例模型； 3．觀察血管移植術(shù)后近、遠(yuǎn)期動物的存活情況和靜脈移植物的通暢情況，使用Fisher精確概率法

11、和CMH X2檢驗(yàn)方法比較這些結(jié)果在不同保存方法和不同保存時間組之間的差別。 結(jié)論： 1. 4℃UW液保存異體血管是一種安全、有效的方法； 2．Uw液冷保存異體血管的效能高于一般鹽溶液； 3．UW液可有效保存異體靜脈長達(dá)3周，鹽溶液的有效保存時間小超過2周； 4．UW液保存的異體血管近期通暢率較為理想，但是遠(yuǎn)期通暢率出于各種原因不甚滿意，尚需要進(jìn)一步深入研究； 5．對僅要求短期內(nèi)建立血流通

12、道的血管替代物來說，UW液冷保存3周之內(nèi)的異體靜脈效果令人滿意。 三、4℃UW液對異體血管保存時限的實(shí)驗(yàn)研究 目的： 1．探討血管存UW液和傳統(tǒng)鹽溶液長時間冷保存過程中組織、細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能改變； 2．探討UW液冷保存法是否優(yōu)于傳統(tǒng)鹽溶液冷保存法。 方法： 1．獲取新西蘭兔的腹主動脈條段作為待研究的血管，分別用UW液和復(fù)方乳酸鈉注射液在4℃條件下冷保存1周、2周、3周及4周，新鮮血管為陰性

13、對照，血管鉗鈍性破壞內(nèi)皮層后的血管設(shè)為陽性對照組，用Evans blue dye(EBD)染色血管內(nèi)皮15s，染色后的血管標(biāo)本經(jīng)甲酰胺溶液處理后沈脫EBD，上清液測吸光值(波長620nm)，在EBD標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出各組樣本中的EBD含量，使用BCA蛋白定量法測定每個血管條樣本中的總蛋白含量，最后計(jì)算出每個樣本單位蛋白質(zhì)含量中的EBD含量(ng/mg)，用t檢驗(yàn)和方差分析對不同保存方法和不同保存時間之間的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析； 2．

14、隨肝腎等器官獲取的同時大量扶取自愿供者的成人髂靜脈和頸內(nèi)靜脈，無損傷方法仔細(xì)修整靜脈，分別用UW液和PBS液在4℃條件下冷保存1周、2周、3周及4周。靜脈內(nèi)膜用0.25％Ⅰ型膠原酶溶液消化60-70min，離心后去上清即得到成人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后倍比稀釋分為不同細(xì)胞含量的懸浮液置入96孔板，用DMEM培養(yǎng)樣將每孔配成100μl容積，放入37℃，5％CO2恒溫箱中培養(yǎng)6-10小時，每孔加入10μl CCK-8，37℃，5％CO2條

15、件下孵育2-4小時，測定小同細(xì)胞濃度的吸光值(檢驗(yàn)波長450 nm，參比波長620nm)，以新鮮靜脈的細(xì)胞數(shù)和OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，每組樣本測定OD值后在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出活性細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算出內(nèi)皮細(xì)胞存活率(新鮮靜脈的存活率為100％)，采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)方法分析不同保存方法和不同保存時間的樣本之間內(nèi)皮細(xì)胞存活率的差異； 3．獲取人靜脈標(biāo)本、分離內(nèi)皮細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)分組同方法2。各組樣本所獲得的內(nèi)皮細(xì)胞用Western b

16、lotting免疫印跡法檢測各組樣本中內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的蛋白水平，觀察不同保存方法和不同保存時間的樣本之間eNOS水平的差異。 結(jié)論： 1．從血管內(nèi)膜完整性、靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活性及功能性蛋白eNOS表達(dá)量等方面來說，存4℃冷保存條件下，UW液對異體血管的有效保存時間可長達(dá)3-4周，鹽溶液的有效保存時間均在2周以內(nèi)； 2．在較短的保存時間(1-2周)內(nèi)，UW液和鹽溶液的保存效果近似； 3．UW液冷

17、保存法要優(yōu)于傳統(tǒng)鹽溶液冷保存法，這種方法可適用于建立臨時、簡易血管庫。 四、4℃UW液保存的異體靜脈移植物在成人活體肝移植肝靜脈分支重建中的臨床應(yīng)用 目的： 探討4℃UW液保存的異體靜脈移植物在活體肝移植肝靜脈重建中的臨床應(yīng)用結(jié)果與價值，探討該方法是否適合建立臨床簡易異體血管庫。 方法： 對我院全軍器官移植研究所2007年06月至2008年01月完成的9例成人間右半肝活體肝移植病例，采用在4℃UW