Angiopoietin-1--2在圍著床期子宮內(nèi)膜的表達(dá)及雌、孕激素對其的體外調(diào)控.pdf

1、第一部分：Angiopoietin-1/-2蛋白和mRNA在小鼠著床期子宮內(nèi)膜中的表達(dá) 目的：研究Ang-1/-2蛋白在小鼠胚胎著床期的子宮內(nèi)膜的分布及其mRNA轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，以探討Ang-1/-2基因在胚胎著床過程中的作用和生物學(xué)意義。 方法：將妊娠第2，4，6和8天的昆明種小鼠脫頸法處死，取其子宮內(nèi)(蛻)膜，進(jìn)行常規(guī)的組織固定、包埋和切片。分別運用免疫組織化學(xué)S-P法和原位雜交技術(shù)，檢查著床期子宮內(nèi)膜中Ang-1/

2、-2蛋白的表達(dá)及其mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。并采用LeizASM型計算機圖像分析技術(shù)檢測不同時期子宮內(nèi)膜中Ang-1/-2表達(dá)的平均光密度值。采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件包，利用t檢驗法檢驗各組間是否存在差異。 結(jié)果：1.Ang-1蛋白及mRNA的表達(dá)結(jié)果：1)免疫組化結(jié)果顯示，Ang-1特異性免疫反應(yīng)產(chǎn)物在基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，隨著妊娠天數(shù)的增加，表達(dá)逐漸增強(P＜0.01)，且上皮細(xì)胞和血管壁辦為Ang-1特異性免疫反應(yīng)陽性結(jié)構(gòu)。2)原

3、位雜交結(jié)果顯示，Ang-1mRNA自妊娠第2天起即表達(dá)于基質(zhì)細(xì)胞中，第4天血管壁胞漿中也出現(xiàn)陽性表達(dá)，且兩者的表達(dá)強度在妊娠第6、第8天時逐漸增加。平均光密度值具有顯著性差異(P＜0.01)。2.Ang-2蛋白和mRNA的表達(dá)結(jié)果：1)免疫組化結(jié)果顯示，Ang-2特異性免疫反應(yīng)產(chǎn)物在基質(zhì)細(xì)胞及腔上皮細(xì)胞胞漿中表達(dá)，隨著妊娠天數(shù)的增加，表達(dá)逐漸增強(P＜0.01)。2)原位雜交結(jié)果顯示，Ang-2mRNA自妊娠第2天起即表達(dá)于基質(zhì)細(xì)胞和腺

4、上皮；第4天血管壁胞漿中也出現(xiàn)陽性表達(dá)，且其表達(dá)強度在妊娠第6，第8天時逐漸增加。平均光密度(OD)值具有顯著性差異(P＜0.01)。 結(jié)論：Ang-1/-2基因在小鼠妊娠過程中的表達(dá)情況提示，Ang-1/-2在著床前小鼠子宮內(nèi)膜的上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞中即開始表達(dá)，并隨妊娠進(jìn)程而逐漸在內(nèi)膜細(xì)胞、血管壁內(nèi)皮細(xì)胞中也出現(xiàn)表達(dá)，且表達(dá)逐漸增強，提示Ang-1/-2對胚胎著床有著重要的作用。同時實驗結(jié)果表明Ang-1/-2的mRNA和蛋白

5、的表達(dá)部位有一定的差別，說明Ang-1/-2基因在胚胎著床過程中可能通過自分泌和旁分泌的形式對血管新生、血管生成和血管重塑起著重要的調(diào)控作用，從而有利于滋養(yǎng)層細(xì)胞在胎母界面移行、擴展并侵入母體子宮內(nèi)膜的基質(zhì)，為囊胚成功著床起了重要的作用。 第二部分:Angiopoietin-1/-2基因在人圍著床期子宮內(nèi)膜的表達(dá) 目的：通過檢測Ang-1/-2蛋白和mRNA在人圍著床期子宮內(nèi)膜中的分布及表達(dá)情況，以研究Ang-1/-2基

6、因的表達(dá)在人著床過程中所起的作用。 方法：分別取排卵期、分泌中期及妊娠40、50天的人子宮內(nèi)膜(蛻膜)，運用免疫組織化學(xué)S-P法和原位雜交技術(shù)檢查著床期子宮內(nèi)膜中Ang-1/-2蛋白的表達(dá)及Ang-1/-2mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)合計算機圖像分析技術(shù)檢測不同時期子宮內(nèi)膜中Ang-1/-2表達(dá)的平均光密度(AOD值)。利用SPSS11.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以檢驗其間是否存在統(tǒng)計學(xué)差異。 結(jié)果：1.免疫組化結(jié)果顯示，1

7、)Ang-1在排卵期和分泌中期的基質(zhì)細(xì)胞中及血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，且分泌中期Ang-1的表達(dá)強，有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異，(P＜0.05)，而在腔上皮細(xì)胞中表達(dá)不明顯。在妊娠的40天和50天，棕黃色特異性免疫反應(yīng)陽性顆粒均勻分布于蛻膜細(xì)胞中；血管壁和血管內(nèi)皮細(xì)胞均為Ang-1特異免疫反應(yīng)陽性表達(dá)。圖像處理結(jié)果示：隨妊娠天數(shù)的增加，Ang-1免疫反應(yīng)的平均光密度值明顯增強，組間比較有顯著性差異，(P＜0.01)。2)Ang-2的表達(dá)結(jié)果：Ang-

8、2在排卵期的腔上皮細(xì)胞、腺上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，在分泌中期表達(dá)稍強，但無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，(P＞0.05)。在妊娠的40天和50天，棕黃色特異性免疫反應(yīng)陽性顆粒均勻分布于蛻膜細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞及腔上皮細(xì)胞中；血管壁辦出現(xiàn)陽性表達(dá)。圖像處理結(jié)果示：隨妊娠天數(shù)的增加，Ang-2免疫反應(yīng)的平均光密度值明顯增強，組間比較有顯著性差異，(P＜0.01)。2.原位雜交結(jié)果顯示，1)Ang-1mRNA在排卵期表達(dá)于基質(zhì)細(xì)胞中，分泌中期在基

9、質(zhì)細(xì)胞、血管壁及血管內(nèi)皮細(xì)胞中出現(xiàn)陽性表達(dá)，且表達(dá)強度增加，(P＜0.05)；Ang-1mRNA在妊娠40d及50d時表達(dá)逐漸增強，(P＜0.05)。2)Ang-2mRNA在排卵期和分泌中期明顯表達(dá)于基質(zhì)細(xì)胞和腺上皮，而血管壁胞漿中弱表達(dá)。但排卵期和分泌中期的表達(dá)強度無顯著性差異，(P＞0.05)。但在妊娠的40d和50d時Ang-2mRNA的表達(dá)明顯增強，平均光密度值具有顯著性差異(P＜0.05)。 結(jié)論：在人胚胎著床過程中，

10、Ang-1/-2在子宮內(nèi)膜的表達(dá)表現(xiàn)出明顯的時空性。提示：Ang-1/-2可能對著床過程中子宮內(nèi)膜的血管新生和血管重構(gòu)起著重要的作用，從而有利于胚泡成功著床；同時Ang-1/-2保持動態(tài)平衡，可能有利于嚴(yán)格控制滋養(yǎng)層細(xì)胞對母體子宮組織的侵入，使滋養(yǎng)層細(xì)胞的浸潤在時間和空間上受到嚴(yán)格的限制。避免細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤功能異常而導(dǎo)致異常妊娠結(jié)局。 第三部分:雌、孕激素對人子宮蛻膜細(xì)胞Angiopoietin-1/-2表達(dá)的體外調(diào)控

11、 目的：觀察雌二醇(17β-E2)、孕酮(Progestrone，P)對體外培養(yǎng)的人著床期子宮內(nèi)膜細(xì)胞Ang-1/-2蛋白表達(dá)的影響，以研究17β-E2、P對Ang-1/-2基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，從而進(jìn)一步闡明Ang-1/-2在著床過程中所起的生物學(xué)作用。 方法：取妊娠40天的子宮蛻膜組織，經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)使之貼壁生長，然后分別加入17β-雌二醇(5×10-8mol/L)，孕酮(1×10-6mol/L)以及孕酮(1×10-6mol/L

12、)+17β-雌二醇(5×10-8mol/L)于各組培養(yǎng)細(xì)胞中，培養(yǎng)12h、1d和2d。固定后運用免疫組織化學(xué)S-P法檢查細(xì)胞中Ang-1/-2蛋白的表達(dá)。RT-PCR檢測Ang-1/-2mRNA的表達(dá)。 結(jié)果：1)免疫組化結(jié)果：17β-雌二醇、孕酮和17β-雌二醇加孕酮三種培養(yǎng)基中Ang-1/-2特異性免疫反應(yīng)產(chǎn)物均在蛻膜細(xì)胞胞漿中表達(dá)。2)RT-PCR結(jié)果：人子宮蛻膜細(xì)胞Ang-1/-2mRNA表達(dá)結(jié)果：(1)17β-雌二醇組

13、：培養(yǎng)12h，17β-雌二醇使蛻膜細(xì)胞中Ang-1mRNA和Ang-2mRNA擴增產(chǎn)物的表達(dá)水平增強。培養(yǎng)1d和2d，Ang-1mRNA擴增產(chǎn)物的表達(dá)水平逐漸增強，但無明顯的統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；Ang-2mRNA擴增產(chǎn)物表達(dá)水平增強，有顯著性差異，(P＜0.05)。(2)孕酮組：培養(yǎng)12h和1d，與對照組相比Ang-1mRNA擴增產(chǎn)物的表達(dá)水平變化不明顯；培養(yǎng)2d后，Ang-1mRNA表達(dá)水平稍下降，(P＞0.05)。Ang-2