肺結(jié)核患者外周血中分泌IL-9的淋巴細(xì)胞亞群的探討.pdf

1、研究背景：L-9長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為是由 TH2類細(xì)胞產(chǎn)生的，可作用于多種炎癥細(xì)胞和組織細(xì)胞，產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)，在過敏性哮喘和寄生蟲感染中發(fā)揮重要作用。IL-9既是一種T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，又可作用于B細(xì)胞，在免疫球蛋白的調(diào)控中發(fā)揮作用。TH9是新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞亞群，可由TGF-β和IL-4聯(lián)合刺激CD4+初始T細(xì)胞產(chǎn)生，也可直接由TGF-β作用于TH2細(xì)胞，而由TH2細(xì)胞分化而來(lái)。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，除TH9細(xì)胞外，Treg細(xì)胞和TH17也可

2、產(chǎn)生IL-9，那么CD8細(xì)胞、γδT細(xì)胞及其它淋巴細(xì)胞亞群是否也產(chǎn)生IL-9？IL-9與IL-17是否有共分泌現(xiàn)象，目前還不太清楚。有研究報(bào)道表明，結(jié)核病人的外周血中IFN-r, IL-12a,IL-12β和IL-23mRNA的表達(dá)水平降低，而IL-9mRNA的水平顯著升高。通過加入外源性的IL-9可抑制IFN-rmRNA的表達(dá)，中和IL-9可恢復(fù)IFN-rmRNA的表達(dá)，這表明IL-9通過抑制TH1細(xì)胞細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而抑制了TH1

3、細(xì)胞抗結(jié)核的功能。在結(jié)核病人中，哪些淋巴細(xì)胞亞群產(chǎn)生IL-9呢？目的：通過檢測(cè)肺結(jié)核患者外周血各淋巴細(xì)胞亞群產(chǎn)生L-9及其相關(guān)因子的比例，來(lái)探討產(chǎn)生IL-9細(xì)胞亞群與結(jié)核病的關(guān)系，為深入研究結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IL-9分泌細(xì)胞的方法學(xué)探討。
　　方法：1.采集23例健康志愿者和26例活動(dòng)期結(jié)核病人外周血，加入佛波醇酯（PMA）和鈣離子酶素(IM)刺激培養(yǎng)6小時(shí)，在后4小時(shí)加入阻滯劑莫能霉素（Mo）,刺激結(jié)束，收

4、集細(xì)胞，加入相應(yīng)熒光標(biāo)記的單克隆抗體進(jìn)行染色，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分泌IL-9、IL-17及IFN-r的淋巴細(xì)胞亞群比例；2.制備Mtb-HAg:收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)核桿菌，高壓滅菌處理制備成Mtb-HAg；3.采用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），用Mtb-HAg和rIL-2刺激培養(yǎng)擴(kuò)增效應(yīng)性γδT細(xì)胞（Mtb-AT），8-11天后，收集細(xì)胞用PMA/IM和Mo以及Mtb-HAg和Mo刺激培養(yǎng)后，加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記單克隆抗體，

5、用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分泌IL-9和IFN-r的γδT細(xì)胞亞群比例；4.采用同一個(gè)體的全血和PBMC同時(shí)用PMA/IM和Mo刺激培養(yǎng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)分泌IL-9淋巴細(xì)胞亞群比例；5.采用同一個(gè)體的全血離心收集上清用ELISA檢測(cè)IL-9的含量；6.PBMC提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄cDNA,PCR檢測(cè)IL-9的mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果:1.結(jié)核（TB）病人和健康者(HD)外周血分泌IL-9的T淋巴細(xì)胞亞群比例比較， TB病人和 HD在 CD3中比

6、例分別為0.32％和0.35%,在 CD4中比例分別為0.21%和0.22%，在CD8中比例分別0.35%和0.32%均無(wú)顯著差異，而在γδT中比例分別為2.93%和1.07%，TB病人的γδT分泌IL-9比例顯著升高(P<0.01)。
　　2. TB病人和HD外周血NK細(xì)胞及B細(xì)胞分泌IL-9的比例比較，HD在NK細(xì)胞和B細(xì)胞中比例分別為0.34%和0.12%，HD組NK細(xì)胞分泌，B細(xì)胞少許分泌；TB病人在NK細(xì)胞和B細(xì)胞比例分

7、別為0.42%和0.14%，NK細(xì)胞分泌，B細(xì)胞少許分泌。
　　3. HD組中全血檢測(cè)到分泌IL-9的各T細(xì)胞亞群比例與PBMC比較，HD組全血與PBMC在CD3中比例分別為0.35%和0.26%,在CD4中比例分別為0.22%和0.23%，在CD8中比例分別為0.32%和0.35%，在γδT中比例分別為1.07%和0.44%，γδT細(xì)胞在全血的比例高于PBMC,其它無(wú)明顯差異。TB組中也是如此，全血與PBMC在CD3中比例分別為

8、0.32%和0.34%，在CD4中比例分別為0.21%和0.29%，在CD8中比例分別為0.35%和0.56%，在γδT中比例分別為2.93%和1.84%，γδT細(xì)胞在全血的比例高于PBMC,其它無(wú)明顯差異。
　　4.用Mtb-HAg再刺激Mtb-AT檢測(cè)IFN-γ和IL-9的分泌，HD和TB組中，產(chǎn)IFN-γ的γδT比例（TB=15.84%，HD=4.50%）均明顯高于單加Mo的未刺激組（TB=0.99%， HD=0.89%），

9、P<0.05,而分泌IL-9的γδT細(xì)胞的比例與單加Mo的未刺激組沒有差異。
　　5. RT-PCR檢測(cè)TB組和HD組的IL-9的mRNA表達(dá)，TB組高于HD組，P<0.05。
　　6. ELISA法檢測(cè)IL-9在TB和HD全血上清的含量分別為7.13pg/ml（n=30）和5.14pg/ml（n=30）,在TB中含量明顯高于HD,P<0.05。
　　結(jié)論:
　　1、用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胞內(nèi)細(xì)胞因子的方法證明，IL-