新細(xì)胞粘附分子LSECtin識(shí)別活化T細(xì)胞的功能及其分子機(jī)制.pdf

1、C-型凝集素超家族在機(jī)體的天然免疫和繼發(fā)免疫中發(fā)揮著重要功能，主要包括病原微生物的識(shí)別與清除以及免疫細(xì)胞的識(shí)別與遷移等。LSECtin是本實(shí)驗(yàn)室在國(guó)際上率先克隆并研究的一種新型凝集素分子，人LSECtin(hLSECtin)cDNA全長(zhǎng)141lbp，編碼293個(gè)氨基酸，為II型跨膜糖蛋白，與已知的凝集素分子DC-SIGN、DC-SIGNR和CD23為同一家族，共屬于C型凝集素超家族。LSECtin特異表達(dá)于肝和淋巴結(jié)。由于其含有典型的C

2、RD結(jié)構(gòu)域(糖基識(shí)別結(jié)構(gòu)域)，體外證實(shí)LSECtin蛋白能夠Ca2+離子依賴(lài)性的結(jié)合甘露糖，巖藻糖和N一乙酰葡萄糖胺。 本論文中，利用免疫組化結(jié)合免疫熒光共定位的實(shí)驗(yàn)方法，~J-FLSECtin表達(dá)在肝臟的Kupffer細(xì)胞和竇內(nèi)皮細(xì)胞，為L(zhǎng)SECtin的功能研究奠定了組織學(xué)基礎(chǔ)。為了證實(shí)LSECtin是免疫細(xì)胞粘附分子的假設(shè)，篩選了一系列血細(xì)胞系，其中活化的人白血病T細(xì)胞系Jurkat與sLSECtin—Fc融合蛋白表現(xiàn)出很強(qiáng)

3、的結(jié)合能力，進(jìn)而分析LSECtin能否識(shí)別生理狀況下的血細(xì)胞，sLSECtin—Fc融合蛋白以及細(xì)胞膜表面的LSECtin均能粘附活化的外周血T細(xì)胞，這些結(jié)果表明LSECtin是肝臟中一種新的活動(dòng)化T細(xì)胞黏附分子。為了鑒定LSECtin在活化T細(xì)胞表面的配體，首先通過(guò)Far-Western實(shí)驗(yàn)確定了LSECtin在活化T細(xì)胞上的配體分子量，進(jìn)而利用生物質(zhì)譜技術(shù)鑒定配體，結(jié)果提示CD44為候選配體分子。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步確證了LSECti

4、n與CD44互為受體一配體分子對(duì)：(1）CD44封閉性抗體能抑制LSECtin與活化T細(xì)胞的粘附；(2)純化的LSECtin蛋白能粘附瞬時(shí)表達(dá)的CD44；(3)純化的CD44蛋白能粘附瞬時(shí)及穩(wěn)定表達(dá)的LSECtin。配體分子的確立為深刻揭示LSECtin在肝臟的生物學(xué)功能提供了強(qiáng)有力的依據(jù)與線索。 體內(nèi)功能的復(fù)雜性與多樣性。從活化T細(xì)胞中擴(kuò)增并克隆出多種有代表性的不同剪切形式的CD44，結(jié)果表明，LSECtin只與其中幾種形式表

5、現(xiàn)出較強(qiáng)的粘附，提示LSECtin有選擇性的識(shí)別特定形成的CD44。在一系列代表性的血細(xì)胞株中，LSECtin與高表達(dá)CD44s(80kD)(CD44有多種剪切形式，CD44s代表CD44標(biāo)準(zhǔn)型)并同時(shí)表達(dá)多種形式CD44(95kD/120kD/140kD)的活化Jurkat細(xì)胞粘附最強(qiáng)，與高表達(dá)CD44s的CEM細(xì)胞的粘附次之，而與低表達(dá)CD44(120kD)的幾種血細(xì)胞不粘附。如前所述，LSECtin含有典型的糖基識(shí)別結(jié)構(gòu)域，能鈣離

6、子依賴(lài)性的識(shí)別糖基，結(jié)果表明，LSECtin與活化T細(xì)胞的粘附依賴(lài)于配體分子的N-連接糖復(fù)合物：(1)鈣離子絡(luò)合劑和已知的LSECtin糖配基能抑制LSECtin與活化T細(xì)胞的粘附；(2)N一糖基化抑制劑Tunicamycin在不降低CD44表達(dá)量的情況下大幅度抑制LSECtin與活化T細(xì)胞的粘附。上述結(jié)果均表明，．LSECtin可能識(shí)別活化T細(xì)胞表面某種或幾種特殊形式的CD44分子(剪切形式和糖基化形式)， 綜上所述，LSEC