Apelin調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子和趨化因子的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：以不同濃度以及不同時(shí)程apelin干預(yù)體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，觀察粘附分子ICAM-1(intercellular adhesion molecule1，細(xì)胞間粘附分子-1)和VCAM-1(Vascular cell adhesion molecule1，血管細(xì)胞粘附分子-1)以及趨化因子MCP-1(Monocyte chemotacticprotein1，單核細(xì)胞趨化因子-1)在apelin干預(yù)后的表達(dá)情況。
　　

2、方法：分離、培養(yǎng)和鑒定人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，以0、10-10、10-9和10-8M apelin干預(yù)12小時(shí)后提取細(xì)胞總RNA檢測(cè)ICAM-1、VCAM-1和MCP-1 mRNA表達(dá)差異。并以最佳干預(yù)濃度apelin干預(yù)細(xì)胞0h、2h、4h、8h、12h和24h，收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清。以熒光定量PCR檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞ICAM-1、VCAM-1和MCP-1 mRNA的表達(dá)差異，以蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白表達(dá)差異，以及以ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培

3、養(yǎng)上清分泌蛋白水平差異。
　　 結(jié)果：Apelin干預(yù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后ICAM-1、VCAM-1和MCP-1 mRNA水平明顯增高，10-8M作用最強(qiáng)。ICAM-1表達(dá)在4h達(dá)最高，表達(dá)曲線呈鐘形，VCAM-1和MCP-1表達(dá)隨干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)漸增強(qiáng)，分別于12h和24h達(dá)峰值。
　　 結(jié)論：Apelin呈濃度和時(shí)間依賴性刺激內(nèi)皮細(xì)胞粘附分ICAM-1和VCAM-1以及趨化因子MCP-1的表達(dá)，apelin所引起的內(nèi)皮細(xì)胞

4、炎癥反應(yīng)提示其可能是一種促動(dòng)脈粥樣硬化因子。
　　 目的：應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞APJ基因的表達(dá)，研究APJ基因沉默后apelin調(diào)節(jié)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)粘附分子和趨化因子的變化，初步闡明apelin-APJ系統(tǒng)在細(xì)胞學(xué)水平上對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化形成的可能調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　 方法：針對(duì)人APJ cDNA編碼序列設(shè)計(jì)shRNA(small hairpinRNA，短發(fā)夾RNA)表達(dá)框，以pGenesil-1 vect

5、or為載體構(gòu)建質(zhì)粒，并設(shè)陰性對(duì)照質(zhì)粒。以脂質(zhì)體為介導(dǎo)對(duì)培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞.APJ mRNA和蛋白表達(dá)鑒定基因沉默效率。以未轉(zhuǎn)染空白對(duì)照、轉(zhuǎn)染陰性siHK質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染siAPJ-2質(zhì)粒的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為研究對(duì)象，apelin分別干預(yù)三組細(xì)胞后，應(yīng)用熒光定量PCR檢測(cè)粘附分子ICAM-1和VCAM-1以及趨化因子MCP-1mRNA表達(dá)，蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：APJ基因沉默后,與未轉(zhuǎn)

6、染空白對(duì)照、轉(zhuǎn)染陰性siHK質(zhì)粒的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞比較，apelin誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子ICAM-1和VCAM-1以及趨化因子MCP-1表達(dá)增高被顯著抑制(ICAM-1被抑制程度超過(guò)90％)。
　　 結(jié)論：APJ作為apelin受體在內(nèi)皮細(xì)胞被誘導(dǎo)表達(dá)粘附分子和趨化因子增高這一反應(yīng)過(guò)程中的地位是不可或缺的，apelin-APJ系統(tǒng)所引起的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)為其促動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制提供了細(xì)胞學(xué)證據(jù)。
　　 目的：闡明JNK(

7、c-Jun N-terminal Kinase，c-Jun氨基末端激酶)和NF-κB(nuclear factor-kappa B，核因子κB)信號(hào)分子是否參與以及如何參與apelin-APJ所導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥的調(diào)節(jié)過(guò)程。
　　 方法：apelin分別干預(yù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞0、5、15、30、60和120 min。提取細(xì)胞磷酸化蛋白行蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)p-JNK表達(dá)；提取細(xì)胞核蛋白和胞漿蛋白行蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)NF-κB

8、-p65和IκBα表達(dá)。以JNK抑制劑SP600125和NF-κB抑制劑SN50分別預(yù)處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后提取細(xì)胞總RNA行逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR檢測(cè)粘附分子ICAM-1和VCAM-1以及趨化因子MCP-1表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：Apelin在60min激起p-JNK表達(dá)高峰，胞核NF-κB-p65蛋白在60min也出現(xiàn)最強(qiáng)信號(hào)，胞漿IκBα蛋白表達(dá)水平于30min出現(xiàn)谷底狀表達(dá)。JNK抑制劑和NF-κB抑制劑預(yù)處理細(xì)胞抑制a