恐懼應激對大鼠下丘腦單胺類遞質(zhì)、ACTH、CORT、IL-2、IL-8的影響及中藥干預.pdf

1、本課題立足于中醫(yī)七情學說，采用經(jīng)典條件反射恐懼模型，運用電化學-高效液相法檢測下丘腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物，放射免疫方法檢測ACTH、CORT、IL2和IL-8。通過對邊緣系統(tǒng)三大遞質(zhì)能神經(jīng)元作用的對比，以及聯(lián)系神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡系統(tǒng)的整體作用，來揭示恐懼發(fā)生的可能機制及中藥調(diào)節(jié)的深層機理。 實驗方法： 1、雄性Wistar大鼠，體重180-220g，隨機分為三組：正常對照組、恐懼模型組、孤獨飼養(yǎng)組，每組8只大鼠

2、?？謶帜Ｐ徒M大鼠單獨飼養(yǎng)于不銹鋼籠(50cm×30cm×20cm)中，自由飲食飲水，飼養(yǎng)10天，第11天13:30將大鼠單獨放入光電刺激儀(30cm×40cm×40cm)，四周為玻璃，底部鋪設銅柵，通以1mA交流電，頂部置10W日光燈)；前5min為適應期，后同時給予電擊和閃光，每次1S，間隔1min，共30min。第12，13天重復實驗。第14天實驗只予光照，不予電擊，攝像記錄第6～30min內(nèi)大鼠行為變化，同時記錄動物處于凍結(jié)狀態(tài)的

3、時間。行為評定采用盲法，三位觀察者觀看錄像評分。實驗結(jié)束立即放入曠場實驗箱內(nèi)，進行應激后行為學檢測。孤獨飼養(yǎng)組大鼠于同樣環(huán)境下孤獨飼養(yǎng)13天，第14天13：30攝像記錄大鼠行為變化，并對其行為學進行評分，14：00放入曠場實驗箱內(nèi)，進行應激后行為學檢測。正常對照組大鼠予以群居飼養(yǎng)，自由飲食飲水，第14天進行行為學測定及曠場實驗。實驗第14天，所有動物曠場實驗后麻醉，斷頭處死，取血，離心制備血清，肝素抗凝離心制備血漿，-20℃凍存。方法按

4、照放射免疫試劑盒說明進行操作，檢測血漿ACTH水平、血清CORT、IL-2、IL8含量。2、雄性Wistar大鼠，體重180-220g，隨機分為三組：正常對照組、恐懼模型組、模型給藥組，每組8只大鼠?？謶帜Ｐ徒M造模方法同前，模型給藥組于電擊實驗前3天桑螵散水煎液灌胃，每日1次，每次2ml，連續(xù)給藥3天。正常動物組大鼠群居飼養(yǎng)，自由飲食飲水。實驗第14天，所有動物麻醉，斷頭處死，取出下丘腦，勻漿，離心，通過高效液相色譜系統(tǒng)(HPLC)加電

5、化學檢測器(ECD)檢測單胺類遞質(zhì)及代謝產(chǎn)物含量。 統(tǒng)計學處理： 實驗結(jié)果用spss13.0統(tǒng)計軟件分析，均用x±s表示，利用Pearson相關分析曠場兩變量之間的關系，采用單因素方差分析方法(One-Way-ANOVA)進行多樣本均數(shù)比較，若存在差異，采用Levene檢驗進行方差一致性檢驗，若方差齊時，用Least-significant differerice(LSD)方法，若方差不齊時用Tamhane’sT2方法。

6、P<0.05被認為有顯著性差異。 主要結(jié)果： (一)大鼠行為學得分及曠場實驗行為學得分恐懼應激大鼠的行為得分與正常對照組及孤獨飼養(yǎng)組比較均有顯著差異(F=72.582，P=0.000)，恐懼應激大鼠行為學得分高于正常對照組及孤獨飼養(yǎng)組。正常對照組與孤獨飼養(yǎng)組比較，無顯著差異(P=0.153)。各組大鼠曠場實驗水平得分、垂直得分、曠場總分均有顯著差異(P<0.01)。水平得分、垂直得分、曠場總分F值分別為23.893、52.3

7、71、40.963：P值均為0.000?？謶帜Ｐ徒M得分低于孤獨飼養(yǎng)組和正常對照組，孤獨飼養(yǎng)組得分高于恐懼模型組，低于正常對照組(P<0.05)。對垂直得分及水平得分進行Pearson相關分析，Pearson相關系數(shù)r=0.730，P=0.000(雙側(cè))，認為水平得分與垂直得分變量之間存在正相關關系。 (二)ACTH、CORT水平比較各組大鼠ACTH、CORT均有顯著差異(F值分別10.466、13.804；均為P<0.01)?？謶帜?/p>

8、型組和正常對照組血漿ACTH比較，有顯著性差異(P=0.043)；與孤獨飼養(yǎng)組血漿ACTH比較，有顯著性差異(P=0.010)；恐懼模型組血漿ACTH水平高于正常對照組及孤獨飼養(yǎng)組?？謶帜Ｐ徒M和正常對照組血清CORT有顯著性差異(P=0.000)，與孤獨飼養(yǎng)組血清CORT比較，亦存在顯著差異(P=0.004)；恐懼模型組CORT水平顯著高于正常對照組及孤獨飼養(yǎng)組。孤獨飼養(yǎng)組與正常對照組ACTH、CORT比較，無顯著差異(均為P>0.05

9、)。 (三)IL-2、IL-8水平比較各組大鼠IL-2未見顯著差異(F=1.355，P=0.280)，各組大鼠IL-8比較，存在顯著差異(F=3.489，P=0.049)，其中恐懼模型組與正常對照組IL-8有顯著差異(P=0.015)，恐懼模型組血清IL-8水平高于正常對照組。孤獨飼養(yǎng)組IL-8水平與恐懼模型組及正常對照組相較，均無顯著差異(均為P>0.05) (四)下丘腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量比較恐懼模型組與正常對照組NE、E、D

10、A、5-HT均有顯著性差異(P值分別為0.022、0.000、0.000、0.023)，恐懼模型組NE、E、DA、5-HT含量均低于正常對照組；恐懼模型組與模型給藥組在NE、E、5-HT方面存在顯著差異(P值分別為0.001、0.007、0.009)，恐懼給藥組NE、E、5-HT含量均高于恐懼模型組，DA水平兩組未見顯著差異(P=0.104)：正常對照組與模型給藥組在NE、E、5-HT方面未見顯著差異(P值分別為0.349、0.101、

11、0.459)，DA水平存在顯著差異(P=0.019)。 (五)下丘腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)代謝產(chǎn)物含量比較恐懼模型組與正常對照組MHPG、HVA存在顯著差異(P值分別為0.004、0.032)，恐懼模型組MHPG、HVA含量低于正常對照組，DOPAC及5-HIAA兩組間未見顯著差異(P值分別為0.518、0.404)；恐懼模型組與模型給藥組在MHPG、5-HIAA水平有顯著差異(P值分別為0.002、0.005)，DOPAC及HVA兩組間未

12、見顯著差異(P值分別為0.760、0.619)：正常對照組與模型給藥組在HVA、5-HIAA水平有顯著性差異(P值分別為0.011、0.034)，MHPG及DOPAC兩組間未見顯著差異(P值分別為0.826、0.482)。 (六)遞質(zhì)與其代謝產(chǎn)物比值變化恐懼模型組與正常對照組在DA/DOPAC比值存在顯著差異(P=0.000)，恐懼模型組DA/DOPAC比值低于正常對照組；正常對照組與模型給藥組DA/DOPAC存在顯著性差異(P=0

13、.003)：5-HT/5-HIAA比值各組間比較未見顯著差異(均為P>0.05)。 (七)遞質(zhì)問平衡關系 5-HT/DA、NE/DA、5-HT/NE在各組比值無顯著性差異(均為P>0.05)。 結(jié)論： 一、依據(jù)經(jīng)典條件反射原理，采用Takashi方法建立恐懼應激模型，在電擊與光照之間建立聯(lián)系，盡量降低軀體刺激的影響，同時在病因上力求符合中醫(yī)情志內(nèi)傷的原則，造模穩(wěn)定性高，方法簡單，可行性好。 二、對恐懼應激模型

14、進行大鼠行為學檢測及應激后曠場行為學檢測，量化評定，根據(jù)行為學得分及曠場實驗分析，恐懼可減弱大鼠興奮性及適應能力，這種表現(xiàn)與人的情緒反應有一定程度的相似性，說明此模型能夠有效模擬人類恐懼情緒，是較為理想的中醫(yī)情志內(nèi)傷模型。 三、恐懼應激可激活HPA軸，從而升高ACTH、CORT水平，恐懼應激模型組和正常對照組ACTH、CORT水平有顯著性差異。 四、恐懼應激對血清IL-2未見顯著影響，各組大鼠IL-2未見顯著差異；

15、 恐懼應激可導致血清IL-8水平升高，與正常對照組差異顯著。五、恐懼應激可導致下丘腦NE、E、DA、5-HT含量降低，恐懼模型組與正常對照組NE、E含量有顯著性差異。 六、恐懼應激可導致下丘腦MHPG、HVA含量降低，恐懼模型組與正常對照組MHPG、HVA存在顯著差異。 七、恐懼應激可導致DA/DOPAC比值下降，恐懼模型組與正常對照組在DA/DOPAC比值存在顯著差異。 八、桑螵蛸散能升高下丘腦NE、E、5-

16、HT含量水平至正常水平，抑制HPA軸活性，桑螵蛸散給藥組與恐懼模型組NE、E、5-HT有顯著性差異，正常對照組與模型給藥組在NE、E、5-HT方面未見顯著差異。 綜上實驗結(jié)果表明：本實驗根據(jù)中醫(yī)七情理論，依據(jù)經(jīng)典條件反射原理建立恐懼應激模型，以行為學指標進行評估，基本符合中醫(yī)情志內(nèi)傷的發(fā)病過程?？謶帜Ｐ徒MACTH、CORT水平含量顯著升高，表明恐懼應激可升高HPA軸活性，提高應激水平；恐懼模型組下丘腦NE、E、DA、5-HT含量