豬不同年齡段肌肉組織microRNAs鑒定和差異表達(dá)分析.pdf

1、骨骼肌占到機(jī)體重的40％左右，任何的身體活動(dòng)和體育活動(dòng)，都是骨骼肌收縮完成。骨骼肌可以通過運(yùn)動(dòng)來增加肌纖維的大小，從而提高機(jī)體的力量和耐力。與此相反，衰老和久坐的生活習(xí)慣將導(dǎo)致肌纖維數(shù)量的減少和功能的紊亂，從而產(chǎn)生一系列的神經(jīng)肌肉疾病。肌肉組織的生長發(fā)育過程受到很多表觀遺傳調(diào)控，如:DNA甲基化、組蛋白修飾、RAN干擾(RNAi)。DNA甲基化和組蛋白修飾主要影響基因的轉(zhuǎn)錄水平，而RNA干擾主要參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。miRNAs是RNA干擾家

2、族中很重要的一員，它作為一類非編碼RNA，在肌肉細(xì)胞分化和組織生長發(fā)育過程發(fā)揮重要作用。miRNAs的表達(dá)具有典型的時(shí)空特異性和組織特異性。豬（Sus scrofa）作為人類重要的蛋白質(zhì)來源，除具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值外，也是醫(yī)學(xué)研究中重要的肥胖和代謝模式動(dòng)物，其體型、代謝特征和心血管系統(tǒng)都比嚙齒動(dòng)物的更接近人類。為了鑒定miRNAs在肌肉生長發(fā)育過程中的作用，本實(shí)驗(yàn)以5個(gè)不同時(shí)間段的骨骼肌為研究對(duì)象(胚胎90天:E90、新生兒:0d、出生后

3、30d:30d、出生后180d:180d和出生后7年:7y)，通過石蠟切片分析不同年齡段肌纖維直徑的差異;利用miRNA-seq方法，鑒定新的miRNAs轉(zhuǎn)錄本;通過差異分析篩選出在骨骼肌生長階段中差異表達(dá)的miRNAs;利用STEM(short time-series expression miner)對(duì)差異基因進(jìn)行表達(dá)模式分析。
　　利用石蠟切片對(duì)不同年齡段的骨骼肌肌纖維直徑和體重分析結(jié)果表明，不同年齡段的豬肌纖維直徑和體重呈

4、現(xiàn)顯著性差異(P＜0.001，one-way ANOVA，n=100)。豬骨骼肌肌纖維直徑生長速率隨著年齡的增加呈現(xiàn)顯著性的降低（P＜0.05），有趣的是，與肌纖維直徑生長速率相比，豬體重的生長速率隨著年齡的變化則呈現(xiàn)不一樣的趨勢，在180d前，豬體重生長速率隨著年齡增加呈現(xiàn)顯著性上升趨勢（P＜0.05），隨后呈現(xiàn)顯著性下降趨勢（P＜0.05）。
　　血清生化指標(biāo)結(jié)果表明，不同年齡段豬血清生化指標(biāo)呈現(xiàn)顯著性的差異（P＜0.05）。

5、有趣的是，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)膽固醇(Cholesterol)和脂蛋白α（Lipoproteinα）隨著年齡的增加而增加，并在180d達(dá)到最高。
　　利用高通量測序技術(shù)，本實(shí)驗(yàn)總共在9個(gè)miRNAs文庫中發(fā)現(xiàn)936個(gè)miRNAs成熟體，對(duì)應(yīng)著629個(gè)前體序列(pre-miRNAs)，其中936個(gè)miRNAs成熟體有404是數(shù)據(jù)庫已經(jīng)報(bào)道了的。此外，有118個(gè)miRNAs與數(shù)據(jù)庫報(bào)道存在單堿基變異（miRNA*s），有286個(gè)miRNAs的序

6、列與數(shù)據(jù)庫內(nèi)報(bào)道序列完全一致，101個(gè)保守miRNA，新發(fā)現(xiàn)miRNAs431條。
　　本實(shí)驗(yàn)miRNAs累積分布結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各文庫表達(dá)量前10位的miRNA的拷貝數(shù)總和至少占據(jù)了各文庫高質(zhì)量reads的52.95％(E90)。
　　利用IDEG6對(duì)9個(gè)文庫的miRNA表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和差異顯著性檢驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)一共鑒定出505個(gè)(505 of903，55.92％)差異表達(dá)的miRNA，其中有176個(gè)(167 of505，33.0

7、7％) miRNA的拷貝數(shù)(reads)大于1000用于后續(xù)分析。
　　利用IDEG6對(duì)5個(gè)年齡段骨骼肌中miRNA文庫進(jìn)行兩兩間比較，分析快速生長階段(E90、0d和30d）和緩慢生長階段(180d和7y)中高富集表達(dá)的miRNAs，一共鑒定出了17個(gè)在快速生長階段（E90、0d和30d）和緩慢生長階段(180d和7y)高富集表達(dá)的miRNAs，其中有10個(gè)miRNAs在快速生長階段特異性上調(diào)，7個(gè)miRNAs在緩慢生長階段（1

8、80d和7y）特異性上調(diào)。
　　使用STEM軟件對(duì)差異表達(dá)的miRNAs數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類和比較，167個(gè)差異miRNAs被聚為10種不同的表達(dá)模式，其中128個(gè)差異miRNAs顯著富集于4種表達(dá)模式（表達(dá)模式1、2、3和4）(P＜0.05)。miRNAs做靶基因預(yù)測及GO和Pathway注釋結(jié)果顯示，在E90和0d中上調(diào)的miRNAs調(diào)控的基因主要富集于大分子物子合成過程和肌肉發(fā)育過程中，在7y中上調(diào)的miRNAs主要參與細(xì)胞凋亡和細(xì)

9、胞程序性死亡過程。
　　此外，9個(gè)具有代表性的差異miRNAs被選擇來驗(yàn)證測序結(jié)果可靠性，熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示，熒光定量PCR與測序結(jié)果之間存在很高的一致性，平均皮爾遜相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.875，充分驗(yàn)證了本研究中測序結(jié)果的可靠性。
　　通過本實(shí)驗(yàn)的研究，不僅增加了豬肌肉組織中表達(dá)的候選miRNAs數(shù)目，而且還可以從miRNAs的角度初步分析了不同年齡段肌肉組織中的生物學(xué)調(diào)控通路差異。為豬肉質(zhì)改良和研究人類年齡相關(guān)疾病提供