人工冬蟲夏草對博萊霉素所致大鼠肺纖維化的干預(yù)作用.pdf

1、特發(fā)性肺纖維化是一種以普通型間質(zhì)性肺炎為特征性病理改變的慢性、彌漫性肺間質(zhì)病變的疾病，其臨床表現(xiàn)主要為進(jìn)行性呼吸困難和刺激性干咳，預(yù)后不良，診斷后的中位生存時(shí)間為3-5年。大部分患者因肺纖維化導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓、呼吸困難、肺源性心臟病和右心衰竭死亡。IPF目前還缺乏特異有效的治療手段。糖皮質(zhì)激素仍作為首選藥物廣泛用于臨床，但其療效不確切，且副作用大。因此研究IPF治療具有非常重要的意義。
　　 冬蟲夏草是我國有兩千多年歷史的傳統(tǒng)藥用

2、真菌，有顯著的抗氧化、抗衰老、抗病毒、抗菌、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等功效。冬蟲夏草臨床效果雖然明顯，但由于產(chǎn)量有限，不能被廣泛應(yīng)用。蝙蝠蛾被毛孢、中華束絲孢、中國被毛孢為同物異名，且為冬蟲夏草菌的無性型菌種。本研究采用的人工冬蟲夏草是采用生物工程方法分離冬蟲夏草后低溫發(fā)酵精制而成的，是以中華束絲孢為生產(chǎn)菌種，與天然冬蟲夏草有相似的化學(xué)成份。目前已初步證實(shí)人工冬蟲夏草在腎間質(zhì)纖維化、支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病動(dòng)物模型有一定的干預(yù)作用。人工冬蟲夏

3、草對實(shí)驗(yàn)性肺纖維化動(dòng)物模型的干預(yù)作用也已經(jīng)有了初步的探討，作用機(jī)制可能是通過抑制TGF-β1在肺組織中的表達(dá)，調(diào)整Ⅰ型/Ⅱ型細(xì)胞因子平衡達(dá)到的，但國內(nèi)外尚未有人工冬蟲夏草對肺纖維化早期肺泡炎階段作用的研究。且從IPF的發(fā)病進(jìn)程、臨床癥狀發(fā)展迅速的特點(diǎn)及現(xiàn)有人工冬蟲夏草的研究來看，人工冬蟲夏草單獨(dú)治療肺纖維化仍缺乏有力的證據(jù)，仍需糖皮質(zhì)激素控制IPF癥狀。目前國內(nèi)外也尚未有研究報(bào)道人工冬蟲夏草聯(lián)合糖皮質(zhì)激素對肺纖維化的治療作用。故本實(shí)驗(yàn)分

4、三部分研究。
　　 第一部分：人工冬蟲夏草對博萊霉素所致大鼠肺纖維化的干預(yù)作用
　　 目的：探討人工冬蟲夏草對博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化的干預(yù)作用。
　　 方法：40只SD大鼠，隨機(jī)分為4組：①正常對照組；②模型組；③蟲草菌液組；④強(qiáng)的松組。采用氣管內(nèi)注射博萊霉素建立模型，次日起分別給予蟲草菌液5g·kg-1·d-1、強(qiáng)的松6mg·kg-1·d-1灌胃治療，Ctr組和Blm組給予生理鹽水灌胃。實(shí)驗(yàn)期間觀察大鼠一般

5、狀況及稱體重。第28d處死動(dòng)物，肺組織標(biāo)本行HE染色病理形態(tài)學(xué)觀察及Ashcroft纖維化評分，肺組織MASSON染色測量膠原面積，堿水解法檢測肺組織HYP含量。
　　 結(jié)果：Ctr組大鼠一般狀況佳，28d后體重較造模前增長(175.4±16.3)g，肺組織結(jié)構(gòu)清晰，無明顯纖維組織增生，纖維化評分為0.54±0.23，血管及氣道壁少量綠色膠原沉積，膠原相對面積為(6.8±0.95)％，肺組織HYP含量為(2053.67±197)

6、μg/g；與Ctr組比較，Blm組大鼠一般狀況差，體重增長量(104.5±23.2g)明顯減少，肺組織結(jié)構(gòu)破壞，重度炎性細(xì)胞浸潤，大塊纖維組織增生實(shí)變，纖維化評分(5.83±1.21)明顯增高，支氣管、血管周邊及肺間質(zhì)大量綠色膠原沉積，膠原相對面積(67.83±16.23％)增加，肺組織HYP含量(4693.76±386μg/g)明顯升高；與Blm組相比，Ccs組大鼠一般狀況改善，體重增長量(173.6±12.6 g)增加，Ccs組可見

7、肺組織損害減輕，纖維組織增生減少，纖維化評分(3.25±0.43)降低，膠原面積(35.22±11.34％)減少，肺組織HYP含量（3812.92±240μg/g）減少。與Blm組相比，Pred組大鼠一般狀況及體重增長量(125.9±16.7 g)無明顯改善，Pred組可見肺組織損害減輕，纖維組織增生減少，纖維化評分(3.48±0.91)降低(P<0.01)，膠原面積(31.48±8.65％)減少(P<0.01)，肺組織HYP含量(37

8、92.02±207μg/g)減少。
　　 結(jié)論：人工冬蟲夏草能夠減輕博萊霉素所致大鼠肺纖維化，改善大鼠一般狀況。
　　 第二部分：人工冬蟲夏草對大鼠肺纖維化作用機(jī)制的初步探討
　　 目的：探討人工冬蟲夏草對大鼠肺纖維化干預(yù)作用的機(jī)制。
　　 方法：80只SD大鼠，隨機(jī)分為14d組和28d組。14d組分為：①正常對照組；②模型組；③強(qiáng)的松；④人工冬蟲夏草組。28d組分為：①正常對照組；②模型組；③人工冬蟲夏

9、草組；④強(qiáng)的松。采用氣管內(nèi)注射博萊霉素建立模型，次日起Ccs28d組、Pred28d組分別給予蟲草菌液5g·kg-1·d-1、強(qiáng)的松6mg·kg-1·d-1灌胃治療，Ctrl4d組、Ctr28d組、Blm14d組和Blm28d組分別給予生理鹽水灌胃。14d組于14d處死動(dòng)物，肺組織標(biāo)本進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)觀察及肺泡炎評分，免疫組化檢測肺組織iNOS表達(dá)，ELISA法檢測BALF TNF-α、GSH、MDA含量及SOD活性；28d組于28d處死

10、動(dòng)物，ELISA法檢測BALF TGF-β1含量，免疫組化檢測肺組織CTGF蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：Ctr14d組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，無炎性細(xì)胞浸潤，肺泡炎評分為0.25±0.10；與Ctr14d組相比，Blm14d組可見肺組織結(jié)構(gòu)破壞，重度炎性細(xì)胞浸潤以及纖維組織增生實(shí)變，肺泡炎評分明顯升高，BALF中TNF-α、MDA含量明顯升高，SOD活力、GSH含量降低，肺組織iNOS表達(dá)明顯上調(diào)；與Blm14d組相比，Ccs14d組、Pr

11、ed14d組肺組織損害減輕，炎性細(xì)胞浸潤以及纖維組織增生明顯減少，肺泡炎評分分別為1.5±0.16、1.37±0.14，均明顯降低，BALF中TNF-α、MDA含量降低(P均<0.01)，GSH含量及SOD活力升高，肺組織iNOS表達(dá)下調(diào)。與Ctr28d組相比，Blm28d組BLAF中TGF-β1的含量明顯升高，CTGF蛋白表達(dá)上調(diào)；與Blm28d組相比，Ccs28d組、Pred28d組能夠降低BALF中TGF-β1的含量，下調(diào)肺組織C

12、TGF蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)人工冬蟲夏草對博萊霉素所致肺纖維化早期肺泡炎階段的干預(yù)作用，可能是通過下調(diào)BALF中TNF-α、肺組織iNOS等細(xì)胞因子的表達(dá)、減少脂質(zhì)過氧化物的釋放，達(dá)到減輕肺泡炎的作用。
　　 (2)人工冬蟲夏草對博萊霉素所致肺纖維化階段的干預(yù)作用，可能是通過減少BALF含量，下調(diào)CTGF表達(dá)，達(dá)到減輕肺纖維化的作用。
　　 (3)人工冬蟲夏草對肺纖維化干預(yù)作用的機(jī)制，可能

13、是通過肺泡炎階段下調(diào)炎癥介質(zhì)及過氧化物表達(dá)，抑制炎癥及氧化損傷對肺纖維階段TGF-β1的活化，下調(diào)CTGF表達(dá)減少CTGF與TGF-β1結(jié)合，達(dá)到抑制ECM合成、減輕肺纖維化的作用。
　　 第三部分：人工冬蟲夏草聯(lián)合糖皮質(zhì)激素對大鼠肺纖維化的干預(yù)作用
　　 目的：人工冬蟲夏草聯(lián)合糖皮質(zhì)激素對大鼠肺纖維化的干預(yù)作用。
　　 方法：105只SD大鼠隨機(jī)分7組：①正常對照組；②模型組；③蟲草菌液組；④常規(guī)劑量強(qiáng)的松組;

14、 ⑤小劑量強(qiáng)的松組; ⑥常規(guī)劑量強(qiáng)的松聯(lián)合蟲草菌液組；⑦小劑量強(qiáng)的松聯(lián)合蟲草菌液組。采用氣管內(nèi)注射博萊霉素建立模型，次日起分別給藥灌胃治療，Ctr組和Blm組給予生理鹽水灌胃。于第28d處死動(dòng)物，肺組織標(biāo)本行HE染色及Ashcroft纖維化評分，肺組織MASSON染色測量膠原面積，堿水解法檢測肺組織HYP含量，免疫組化檢測肺組織TGF-β1蛋白表達(dá)，蛋白免疫印跡法檢測肺組織PDGF-BB蛋白表達(dá)，ELISA法檢測肺泡灌洗液上清bFGF含

15、量。
　　 結(jié)果：Ctr組大鼠一般狀況佳，體重增長量為(184.4±19.4)g；與Ctr組比較，Blm組大鼠一般狀況差，體重增長量(119.5±28.6g)明顯減少；與Blm組相比，C-Pred組一般狀況無明顯改善，體重增長量(128.72±21.9g)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；其余各治療組大鼠一般狀況改善，體重增長量增加，其中C-Com組。Ctr組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，無明顯纖維組織增生，纖維化評分為0.61±0.43，血管及氣道壁少量綠色膠

16、原纖維沉積，膠原面積為(9.41±1.86)％；與Ctr組相比，Blm組可見肺組織結(jié)構(gòu)破壞，重度炎性細(xì)胞浸潤，大塊纖維組織增生實(shí)變，纖維化評分(4.63±1.21)升高，支氣管、血管周邊及肺間質(zhì)大量綠色膠原沉積，膠原面積(69.63±7.09)增加，肺組織HYP含量升高，TGF-β1蛋白、PDGF-BB蛋白表達(dá)上調(diào)，BLAF中bFGF含量升高；與Blm組相比，Ccs組、C-Pred組可見纖維組織增生減少，纖維化評分降低，膠原面積減少，H

17、YP含量下降，TGF-β1蛋白表達(dá)下調(diào)，PDGF-BB蛋白表達(dá)下調(diào)，Ccs組bFGF含量降低，C-Pred組bFGF含量無明顯改變；C-Com組分別與Ccs組、C-Pred組比較，能夠進(jìn)一步降低肺纖維化評分，進(jìn)一步減少膠原面積，降低HYP含量、bFGF含量，下調(diào)TGF-β1蛋白、PDGF-BB蛋白表達(dá)，L-Com組分別與Ccs組、L-Pred組比較，能夠進(jìn)一步降低肺纖維化評分，進(jìn)一步減少膠原面積，降低HYP含量、bFGF含量，下調(diào)TGF

18、-β1蛋白，其中PDGF-BB蛋白表達(dá)與Ccs組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論：
　　 (1)人工冬蟲夏草聯(lián)合強(qiáng)的松對博萊霉素所致肺纖維化有協(xié)同治療作用，并能改善大鼠一般狀況。
　　 (2)人工冬蟲夏草聯(lián)合強(qiáng)的松對肺纖維化協(xié)同治療作用的機(jī)制，可能是通過協(xié)同抑制TGF-β1、bFGF、PDGF-BB等促細(xì)胞外基質(zhì)合成因子，達(dá)到協(xié)同減輕肺纖維化的作用。
　　 (3)小劑量強(qiáng)的松聯(lián)合人工冬蟲夏草與常規(guī)劑量強(qiáng)的