炎癥通路與胰島素抵抗關(guān)聯(lián)機(jī)制的研究.pdf

1、本研究分為如下三部分： 第一部分：炎癥因子與胰島素抵抗關(guān)系的臨床研究 目的：探討不同胰島素敏感性個體血漿炎癥因子水平以及炎癥通路激活狀態(tài)的差。 方法：本研究收集體檢對象38例，依體重指數(shù)分為兩組，肥胖組22例，非肥胖正常對照組16例，以HOMA-IR指數(shù)評價研究對象胰島素敏感性。酶免測定不同胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)個體炎癥因子IL-6、IL-1β、TNFα血漿水平。Westernblot方法檢測外周血白細(xì)胞IKK，IκB及

2、其磷酸化蛋白表達(dá)量的變化。EMSA方法檢測外周血白細(xì)胞核因子NFκB的結(jié)合活性。 結(jié)果：肥胖組空腹胰島素、HOMA-IR指數(shù)、糖化血紅蛋白、血漿甘油三酯、IL-6和IL-1β水平顯著高于正常對照組，TNFα水平組間無顯著差異。偏相關(guān)分析顯示血漿炎癥因子水平與HOMA-IR指數(shù)無顯著相關(guān)性。外周血白細(xì)胞胞漿和胞核蛋白Westernblot和EMSA結(jié)果顯示，伴隨IKKα，IKKβ表達(dá)的升高，IκBα絲氨酸磷酸化水平增高，IκBa表

3、達(dá)下調(diào)，肥胖組NFκB結(jié)合活性較正常對照組顯著增強(qiáng)。 結(jié)論：肥胖組血漿炎癥因子IL-6、IL-1β水平顯著升高。IKK-IκB-NFκB通路的激活參與肥胖個體胰島素抵抗的形成。 第二部分：高脂飼養(yǎng)肥胖大鼠胰島素抵抗與炎癥通路關(guān)系的研究 目的：觀察在整體水平阻斷IKK，PP2A活性，對高脂飼養(yǎng)肥胖大鼠胰島素敏感性的影響，探討對胰島素靶組織受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白表達(dá)及其磷酸化的調(diào)節(jié)作用。 方法：3周齡雄性SD

4、大鼠60只隨機(jī)分組給予普通飼料(5只)、高脂飼料(55只)飼養(yǎng)20周，觀察各組大鼠體重、血糖、胰島素和脂代謝指標(biāo)的變化，用口服葡萄糖糖耐量試驗評估高脂飼養(yǎng)組大鼠胰島素抵抗程度，篩選胰島素抵抗造模成功大鼠共24只，再隨機(jī)分組，每組6只，分別予高脂飼料、舒林酸、岡田酸、羅格列酮干預(yù)，4周后以高胰島素正葡萄糖鉗夾試驗評價不同干預(yù)組大鼠胰島素敏感性變化。大鼠胰島素靶組織取材分別提取蛋白和RNA，實時熒光RT-PCR和Westemblot技術(shù)觀察

5、IKK，PP2A在胰島素靶組織基因和蛋白表達(dá)水平的變化，以及IRS-1Ser/Tyr殘基磷酸化水平的狀態(tài)。用免疫共沉淀的方法探討自然狀態(tài)下IKK，PP2A與IRS-1，胰島素受體β亞基(IR-β)之間的相互作用。 結(jié)果：高脂飼養(yǎng)20周后，高脂組大鼠體重，葡萄糖負(fù)荷后2h血糖以及血清甘油三酯水平顯著高于對照組。透射電鏡觀察提示，高脂飼養(yǎng)組大鼠肝細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞內(nèi)可見大小不等的脂滴，部分細(xì)胞器丟失，線粒體腫脹伴空泡變性。高胰島素正糖

6、鉗夾實驗表明高脂飼養(yǎng)組大鼠葡萄糖清除率顯著下降，提示胰島素抵抗大鼠模型成功建立。羅格列酮和蘇林酸干預(yù)組大鼠葡萄糖清除率較高脂飼養(yǎng)組大鼠顯著上升。實時RT-PCR和Westernblot結(jié)果分別提示IKKβ，PP2A在胰島素靶組織表達(dá)無顯著差異。蘇林酸干預(yù)組大鼠肝臟和骨骼肌IKKα/β(ser180/181)表達(dá)顯著下降，IκBα表達(dá)明顯增加，IRS-1酪氨酸磷酸化表達(dá)上調(diào)，而絲氨酸磷酸化表達(dá)下降。岡田酸干預(yù)組大鼠肝臟PP2A甲基化表達(dá)水

7、平顯著下降，IRS-1Ser/Tyr殘基的磷酸化水平無顯著變化。免疫共沉淀結(jié)果表明，IKKα、IKKβ與IRS-1；IκBα與IRβ亞基間存在相互作用；PP2A與IRS-1間可能沒有直接、穩(wěn)定的相互作用。 結(jié)論：長期高脂飲食可誘導(dǎo)大鼠胰島素抵抗。舒林酸通過調(diào)節(jié)IRS-1Ser/Tyr殘基的磷酸化水平，可以改善高脂飲食肥胖大鼠的胰島素敏感性。岡田酸干預(yù)未直接影響胰島素受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白IRS-1的磷酸化。IKK與IRS-1之間存在

8、直接的相互作用。 第三部分：炎癥通路激活狀態(tài)對3T3L1脂肪細(xì)胞胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響 目的：探討阻斷IKK，PP2A活性，對3T3L1脂肪細(xì)胞胰島素受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白表達(dá)及其磷酸化的影響。 方法：觀察了3對不同序列IKKα-siRNA1-3，IKKβ-siRNA1-3對前3T3L1脂肪細(xì)胞株(第9代)和誘導(dǎo)分化成熟的脂肪細(xì)胞IKKα，IKKβ表達(dá)的抑制程度。實時熒光RT-PCR和Westernblot方法檢測

9、不同濃度IL-1β和/或IKK特異阻斷劑蘇林酸、PP2A特異阻斷劑岡田酸對3T3L1脂肪細(xì)胞IKK，PP2A表達(dá)的調(diào)節(jié)以及IRS-1Ser/Tyr殘基磷酸化狀態(tài)的影響。建立脂肪細(xì)胞/胰島細(xì)胞、脂肪細(xì)胞/胰島細(xì)胞上清夜共培養(yǎng)體系，培養(yǎng)48h后Western-blot方法檢測脂肪細(xì)胞GLUT4蛋白表達(dá)水平的差異。 結(jié)果：IKKα-siRNA，IKKβ-siRNA可有效抑制3T3L1前脂肪細(xì)胞IKK的表達(dá)，其中IKKα-siRNA1，

10、IKKβ-siRNA1抑制效率最高，但siRNA序列對誘導(dǎo)分化成熟的脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)染、抑制效率不足。IL-1β10ng/ml可誘導(dǎo)3T3L1成熟脂肪細(xì)胞IKKβmRNA表達(dá)顯著增加，而IRS-1酪氨酸的磷酸化水平明顯下降。蘇林酸可逆轉(zhuǎn)IL-1β誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞IRS-1酪氨酸磷酸化的表達(dá)水平，同時下調(diào)IRS-1絲氨酸磷酸化的表達(dá)水平。岡田酸顯著抑制3T3L1脂肪細(xì)胞PP2A甲基化的表達(dá)，但對IRS-1的磷酸化水平無顯著影響。脂肪細(xì)胞和胰島細(xì)胞共