NPY受體亞型對心肌肥厚大鼠心臟結構和功能影響的研究.pdf

1、背景：
　　心肌肥厚是心臟對血液動力超負荷及神經體液刺激的代償性反應，是心臟功能從代償期向失代償期演變及心臟結構不可逆發(fā)展的關鍵階段，心肌肥厚即使在早期也是一種有害的反應，可增加心血管疾病的發(fā)病率及死亡率，是心肌缺血、嚴重心律失常和心源性猝死的獨立危險因素。持續(xù)的心肌肥厚使心肌細胞某些蛋白、基因的表達發(fā)生改變，心肌細胞凋亡增加，引起心肌細胞的喪失和功能的惡化最終發(fā)展至失代償性心力衰竭。神經肽Y(Neuropeptide Y，NPY

2、)是36個氨基酸殘基構成的蛋白多肽，與胰多肽（PP）、肽 YY(PYY)同屬一個家族。大量研究證實NPY廣泛分布于哺乳動物的中樞和周圍神經系統(tǒng)中，并與該部位神經元中的其他神經遞質共同釋放，廣泛參與循環(huán)系統(tǒng)的功能調節(jié)，這種調節(jié)作用主要有：直接的收縮和舒張血管；潛在的促內皮細胞、血管平滑肌細胞有絲分裂；心肌收縮的變力性及變時性；作為心肌肥厚的前刺激原。NPY可顯著促進早期肥大反應基因 c-jun mRNA、中期肥大反應基因、胚心基因(MHC

3、)和心鈉素(ANF)表達。體外實驗表明NPY在pM級濃度就可刺激蛋白合成，增加細胞內總蛋白含量，在nM級濃度可抑制蛋白降解。體內、外實驗均證實NPY是誘導心肌肥厚的一個重要介質，同其它肥大因子共同作用引起心肌肥厚，NPY在高血壓的發(fā)展和維持過程中起重要作用，參與高血壓及心肌梗死相關的心肌重構，使心功能惡化或失代償而出現(xiàn)明顯的心力衰竭癥狀。
　　NPY存在六種G蛋白耦聯(lián)受體，其中五種已在哺乳動物中得到克?。╕1，Y2，Y4，Y5，y

4、6），最近有學者推斷Y3受體可能是由Y1，Y2，Y5受體組成的異源三聚體。由于在大多數(shù)哺乳動物體內y6受體蛋白是被截短的，所以認為y6受體僅存在于低等動物體內，同Y3受體一樣其藥理學特性仍然存在爭議。六種NPY受體中，Y1，Y2，Y5受體是心臟中主要存在的受體亞型，參與了NPY對心臟功能的各種調節(jié)過程。
　　我們前期體外研究已經證實NPY受體亞型Y1、Y2、Y5在成年大鼠心肌組織中均有表達；NPY通過Y1受體、Y5受體誘導心肌肥厚

5、，Y2受體對肥厚起到負調控作用；在壓力超負荷心肌肥厚中，四種受體表達均降低，Y2受體降低幅度最大，而Y1受體降低最少，由此導致的綜合效應是，NPY誘導心肌向肥厚方向發(fā)展。本研究將根據(jù)我們體外實驗的結論，針對Y1、Y2、Y5受體進行體內實驗，進一步闡明NPY受體亞型在心臟結構和功能調節(jié)中的作用，為以后應用相應的受體激動劑或抑制劑預防及治療心肌肥厚及相關的心臟并發(fā)癥提供理論依據(jù)和實驗基礎。同時，通過超聲心動圖、血流動力學和病理組織學等方法評

6、價腹主動脈縮窄術后不同時間點大鼠心肌肥厚情況，探討大鼠壓力超負荷性心肌肥厚模型建立的最佳方法。
　　第一部分：心肌肥厚動物模型的建立
　　研究目的：
　　改良傳統(tǒng)壓力超負荷性動物模型建立方法，探討構建心肌肥厚大鼠模型的最佳方式，應用超聲心動圖無創(chuàng)動態(tài)檢測心肌肥厚大鼠心臟結構和功能的變化，為進一步進行心肌肥厚的干預提供基礎。
　　研究方法：
　　1.縮窄大鼠腹腔動脈與前腸系膜動脈分支之間的腹主動脈，建立大鼠壓

7、力超負荷性心肌肥厚模型。
　　2.應用超聲心動圖、血流動力學及病理組織學（心臟重量指數(shù)、HE染色及Masson三色染色）方法觀察AAC術后3、4、6周大鼠心肌肥厚及心功能的變化。
　　3.采用Elisa方法檢測大鼠BNP血漿濃度。
　　結果：
　　1.超聲心動圖檢測發(fā)現(xiàn)：與Sham組相比，大鼠AAC術后3、4、6周的IVS、LVPW明顯增加，4周時增加最明顯（P<0.01，3周時IVSs P<0.05）；無明顯的

8、室腔擴大表現(xiàn)；FS、EF及CO值明顯下降，4周時下降最明顯，6周時稍有恢復(P<0.01，F(xiàn)S、EF值3周時P<0.05，6周時FS、EF、CO P>0.05)，但均在正常范圍；PFVA、E峰值明顯下降，PFVA在4周時下降最明顯（P<0.01，3周時PFVA P>0.05），由于大鼠心率較快，以至于不能測量E/A比值；根據(jù)超聲測量數(shù)據(jù)通過公式計算的左室重量與實際稱重值有非常強的相關性（r=0.997）。
　　2.血流動力學檢測A

9、AC術后3、4、6周的SBP、DBP、平均動脈壓、脈壓、左室內壓、Max dP/dt、Min-dP/dt均較Sham組顯著升高（P<0.01），以上各指標4周時升高最明顯（P<0.01）。Tau值各組間無明顯差異（P>0.05）。
　　3. AAC術后3、4、6周LVMI、HMI、CSA、PVFR均明顯增加（P<0.01，PVFR6周時P<0.05），4周時增加最顯著，IFR各組間無顯著性差異（P>0.05）。
　　4.各時

10、間點AAC組血漿BNP水平均明顯高于Sham組（P<0.01）,隨術后時間的延長，AAC組大鼠血漿BNP水平逐漸升高。
　　小結：
　　1.縮窄大鼠腹腔動脈與前腸系膜動脈分支之間的腹主動脈，術后4周可出現(xiàn)明顯的心肌肥厚，是一種較為理想的心肌肥厚動物模型建立方法，為后續(xù)的干預研究提供了基礎。
　　2.無創(chuàng)超聲心動圖可準確評價大鼠心臟結構和收縮功能的變化，對舒張功能的評價尚需進一步的探索。
　　3.心肌肥厚大鼠血漿B

11、NP濃度明顯升高，且隨術后時間的延長逐漸升高。
　　第二部分：NPY受體亞型對心肌肥厚大鼠心臟結構和功能的影響
　　研究目的：
　　應用高特異性和親和力的受體抑制劑——BMS193885(Y1)、BIIE0246(Y2)、L152804(Y5)以及Y2受體激動劑——C2-NPY，通過腹腔注射至大鼠體內，在體觀察各受體對心臟結構和功能的影響，為心肌肥厚及相關的心臟并發(fā)癥藥物干預提供理論依據(jù)和實驗基礎。
　　研究方法

12、：
　　1.按第一部分方法建立AAC心肌肥厚大鼠模型。
　　2.術后第3天各組大鼠開始分別注射Y1、Y2、Y5受體抑制劑、Y2受體激動劑及對照溶劑，每天腹腔注射1次，連續(xù)注射7周。
　　3.超聲心動圖檢測：分別于術前、術后3天、3、5、7周行超聲心動圖檢測，動態(tài)觀察大鼠心臟結構和功能的變化。
　　4.血流動力學檢測：術后7周心臟超聲檢測后24小時內行血流動力學檢測。
　　5.心臟稱重，取部分心肌組織行HE及

13、Masson染色。
　　6. Elisa法檢測大鼠NPY、BNP血漿濃度；放免法測定大鼠血漿AngⅡ、Ald含量；生化法檢測血漿CRP及肝腎功能。
　　7. Western blot方法檢測心肌組織Y1、Y2、Y5受體及TGF-β1蛋白表達。
　　結果：
　　1. Y1受體抑制劑（BMS193885）
　　與Sham組相比，BMS193885組、10％乙醇對照組的LVMI、HMI、CSA、PVFR、IFR、

14、SBP、DBP、血漿BNP、NPY、AngⅡ、Ald濃度、TGF-β1蛋白表達均顯著性增加（P<0.01，10%乙醇對照組的Ald血漿濃度 P<0.05）；IVSd、LVPWd3、5、7周時均顯著性增加（P<0.01）；Y1、Y2、Y5受體蛋白表達均顯著性降低（P<0.01）。與10%乙醇對照組相比，BMS193885組的HR7周時顯著性增加（P<0.01），EF值3周時顯著性降低（P<0.05）； Max dP/dt、Min-dP/d

15、t及血漿NPY濃度均顯著性降低（P<0.01）；而兩組間LVMI、HMI、IVSd、LVPWd、CSA、PVFR、IFR、SBP、DBP、左室內壓，血漿 BNP、AngⅡ、Ald濃度及Y1、Y2、Y5、TGF-β1蛋白表達無顯著性差異。
　　2. Y2受體抑制劑（BIIE0246）和激動劑（C2-NPY）
　　與Sham組比較，BIIE0246組、C2-NPY組、10%乙醇對照組、NS對照組的LVMI、HMI、CSA、PVF

16、R、IFR、SBP及DBP均顯著性增加（P<0.01，BIIE0246組的LVMI、NS對照組的IFR、SBP、DBP P<0.05，BIIE0246組的HMI、IFR、SBP、DBP P>0.05）；BIIE0246組、10%乙醇對照組的IVSd、LVPWd3、5、7周時均顯著性增加（P<0.01，BIIE0246組的IVSd3、5、7周時、LVPWd5周時P<0.05）；C2-NPY組、NS對照組的IVSd、LVPWd5、7周時均顯

17、著性增加（P<0.01，NS組5周時 P<0.05）；除BIIE0246組血漿NPY濃度顯著性降低外（P<0.01），BIIE0246組、C2-NPY組、10%乙醇對照組、NS對照組的BNP、NPY、AngⅡ、Ald血漿濃度、TGF-β1蛋白表達均顯著性升高（P<0.01，BIIE0246組、10%乙醇對照組的Ald血漿濃度、NS對照組的TGF-β1蛋白表達 P<0.05）；BIIE0246組、C2-NPY組、10%乙醇對照組、NS對照

18、組的Y1、Y2、Y5受體蛋白表達均顯著性降低（P<0.01）。
　　與10%乙醇對照組比較，BIIE0246組的LVMI、HMI、IVSd、LVPWd、CSA、PVFR以及IFR均顯著性降低（P<0.01，HMI、LVPWd、IFR P<0.05）；HR3、7周時心率顯著性降低（P<0.05），EF值3、5周時顯著性降低（P<0.01）；SBP、DBP、左室內壓、Max dP/dt、Min-dP/dt及血漿NPY濃度均顯著性降低（

19、P<0.01）；但BNP、AngⅡ、Ald血漿濃度及Y1、Y2、Y5受體、TGF-β1蛋白表達兩組間無統(tǒng)計學差異。與NS對照組相比，C2-NPY組的LVMI、HMI、IVSd、LVPWd、CSA、PVFR以及IFR均顯著性增加（P<0.01，IVSd、LVPWd P<0.05）；HR在3、5、7周時顯著性增加（P<0.01,5周時 P<0.05），EF值在3周時顯著性升高（P<0.05）；SBP、DBP、血漿BNP、NPY濃度、TGF-

20、β1、Y2、Y5受體蛋白表達明顯升高（P<0.01，SBP、DBP、Y2、Y5受體蛋白表達P<0.05）；兩組間Max dP/dt、Min-dP/dt、血漿AngⅡ、Ald濃度，Y1受體蛋白表達無統(tǒng)計學差異。
　　3. Y5受體抑制劑（L152804）
　　與10%乙醇對照組相比，L152804組的HR7周時明顯升高（P<0.01），EF值3周時顯著性降低（P<0.01），在第5周后恢復；SBP、DBP、左室內壓、Max d

21、P/dt、Min-dP/dt及血漿 NPY濃度均顯著性降低（P<0.01，SBP、Min-dP/dt P<0.05），而 LVMI、HMI、IVSd、LVPWd、CSA、PVFR、IFR、血漿 BNP、AngⅡ、Ald濃度及Y1、Y2、Y5受體、TGF-β1蛋白表達兩組間無明顯差異。
　　4.藥物副作用
　　與Sham組相比，BMS193885組、BIIE0246組、C2-NPY組、L152804組、10%乙醇對照組、NS對

22、照組的血生化除C2-NPY組的Cr及CRP顯著性降低外（P<0.05）其他指標均無明顯變化。
　　小結：
　　1. NPY通過Y1受體使心肌肥厚大鼠心率減慢，心肌收縮力增強，對血壓及心肌肥厚無明顯影響。
　　2. NPY通過Y2受體使心肌肥厚大鼠心率增快，心肌收縮力增強，血壓升高并進一步加劇心肌肥厚。
　　3. NPY通過Y5受體使心肌肥厚大鼠心率減慢，心肌收縮力增強，血壓升高，對心肌肥厚無明顯影響。
　　

23、全文結論：
　　縮窄大鼠腹腔動脈與前腸系膜動脈分支之間的腹主動脈，術后 4 周可出現(xiàn)明顯的心肌肥厚，是一種較為理想的心肌肥厚動物模型建立方法。在壓力超負荷導致的心肌肥大中，NPY通過Y1受體減慢心率，增強心肌收縮力；通過Y2受體使心率增快，心肌收縮力增強，血壓升高并進一步加劇心肌肥厚；通過Y5受體使心率減慢，心肌收縮力增強，血壓升高。由上述結果可知，在壓力超負荷時，NPY 血漿濃度升高可增強心肌收縮力，調節(jié)心率的變化，在代償期為維