Apelin對心肌缺血大鼠心臟側枝循環(huán)的影響和機制.pdf

1、心肌梗死是威脅人類健康的重要心血管疾病之一,是引起猝死和心力衰竭的主要因為,所以有必要進行積極有效的再灌注治療,以挽救瀕死心肌。再灌注的形式,包括心血管介入治療,冠狀動脈搭橋,干細胞移植等,其中心臟的側枝循環(huán)形成對于防止心肌梗死,心功能的保護具有重要意義。
　　 Apelin是1998年日本學者Tatemoto從牛胃組織提取物中分離出一種小分子多肽,是血管緊張素受體AT1相關受體蛋白(Angiotension Ⅱ Protein

2、 J,APJ)的內源性配體,Apelin/APJ信號通路可以促進細胞內多種信號通路的激活產生多種生理功能。Apelin在心血管系統(tǒng)高度表達,它具有增強心肌收縮力、擴張血管、減輕心臟負荷、促進血管生長、調節(jié)水鹽平衡等作用,其中Apelin促進血管形成的作用,越來越引起學者的重視。
　　 Apelin信號對心臟和血管的形成有重要作用。它在視網膜血管的內皮層中也高度表達,Apelin足一個視網膜內皮細胞的血管生成因子。與許多其它的血管

3、生成因子相似,在低氧的情況下,Apelin基因的表達是增加的。用反義技術抑制Apelin的表達會導致血管生成障礙,Apelin具有促有絲分裂、促進分化和抑制凋亡的作用。另外,Apelin及其受體Agtrlb還控制斑馬魚原腸時期心臟形態(tài)的發(fā)生,Apelin和Agtrllb受體表達不足或者表達過度都將導致心臟前體缺陷并最終祟及心臟發(fā)育。另外,Apelin會加速血管生成開關的打開,潛在的激活了腫瘤的新生血管形成。Apelin基因在三分之一的人

4、類腫瘤中表達上調。Apelin促進新生血管的特性,已經在小鼠的腫瘤新生血管形成過程中得到證實。
　　 Apelin對內皮細胞的促有絲分裂和血管生成的特性意味著它也許在治療與血管生成有關的疾病方面有潛在的作用。APJ的受體激動劑或許能夠作為藥理學工具在血管形成對抗缺血性疾病方面有治療意義,而它的拈抗劑或許能夠阻止血管形成,以阻止腫瘤生長和缺血性視網膜病。Apelin作為一個強有力的內皮生長和血管生成的刺激因子,激活這種信號通路,能

5、否促進缺血心肌的血管生成,減輕心肌缺血所致的損傷或者壞死,目前尚不得而知。
　　 本課題旨在通過觀察:Apelin是否參與和保護心肌缺血損傷及其機制；外源性給予Apelin能否促進內皮細胞的增殖,遷移和血管形成；外源性給予Apelin能否增加心肌細胞側支循環(huán)的形成,Apelin是通過那個通路促進血管的形成的,從而為挽牧缺血、瀕死的心肌尋找一條有效的途徑。
　　 目的：
　　 1、建立在體大鼠心肌缺血模型,觀察心肌

6、缺血時Apelin足否對心臟有保護作用及其機制。
　　 2、外源性給予Apelin能否促進心臟側支循環(huán)的形成,減少心肌缺血或者心肌梗死。
　　 3、通過HUVECs了解Apelin對內皮細胞增殖,遷移和血管形成的影響,以探討Apelin促進血管形成的可能機制,以及這種機制是否與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)轉導通路相關。
　　 方法：
　　

7、1、Apelin對心肌缺血大鼠的心臟保護作用
　　 (1)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠左冠狀動脈前降支結扎,建立心肌缺血模型。腹腔注射Apelin(1μg/kg.d×2),應用心導管檢查心率(HR)、左室最大收縮壓(LVESP)、左室舒張末期壓(LVEDP)、左室內壓最大升降速度(±dP/dTmax)以評價Apelin對心功能的影響。
　　 (2)雄性SD大鼠冠狀動脈前降支結扎,建立心肌缺血模型,腹腔注射

8、Apelin(1μg/kg.d×2),抽血檢測血中乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)含量。
　　 2、Apelin對心肌缺血大鼠心臟側枝循環(huán)的影響
　　 (1)大鼠冠狀動脈前降支結扎,建立心肌缺血模型,同時給予Apelin腹腔注射(1μg/kg.d×7)以觀察Apelin對心臟側枝循環(huán)的影響。
　　 (2)酶聯(lián)免疫法(enzyme linked immunosorbent assay

9、,ELISA)測定大鼠心肌缺血損傷時血小板-內皮細胞粘附分子1(PECAM1/CD31)蛋白含量。
　　 (3)伊文氏藍和紅四氮唑(TTC)雙染色,應用計算機圖象分析系統(tǒng)計算心肌梗死面積。
　　 (4)通過CD31免疫組化染色,在顯微鏡下觀察缺血心肌組縱的血管生成情況。
　　 (5)HE染色顯微鏡下觀察缺血心肌組織的損傷情況。
　　 (6)通過western blot檢測VEGF和CD31的表達。

10、　　 3、Apelin對內皮細胞增殖,遷移和血管形成的影響
　　 (1)應用甲基噻嘩皋四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)的方法觀察Apelin對HUVECs增殖的影響。
　　 (2)通過Transwell觀察Apelin對HUVECs遷移的影響。
　　 (3)應用Tubeformation觀察Apelin對HUVECs血管形成的影響。
　　 結果：
　　 1

11、、Apelin對心肌缺血大鼠心功能的保護作用與其它各組比較,大鼠心肌缺血48h時Apelin治療組(1μg/kg.d×2,腹腔注射)能明顯提高LV±dp/dtmax、LVESP,降低LVEDP(P<0.05、0.01)。
　　 2、Apelin對心肌缺血大鼠心肌酶的影響自動生化儀結果顯示,大鼠心肌缺血48h時Apelin治療組(1μg/kg.d×2,腹腔注射)的LDH含量明顯較其它各組為低(P<0.01)。
　　 3、A

12、pelin對心肌缺血大鼠CD31表達的影響酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定大鼠心肌缺血大鼠的CD31結果顯示,Apelin治療組(1μg/kg.d×7,腹腔注射)的CD31含量明顯較其它各組為高(P<0.05)。
　　 4、伊文氏藍和紅四氮唑(TTC)雙染色,通過計算機圖象分析系統(tǒng)統(tǒng)計心肌梗死面積結果發(fā)現(xiàn),Apelin治療組(1μg/kg.d×7,腹腔注射)的心肌梗塞面積明顯較其它各組為低(P<0.05)。
　　 5、Ape

13、lin對心肌缺血大鼠微血管密度的影響CD31免疫組化染色,顯微鏡下觀察心肌組織的微血管密度(MVD,microvessel density)發(fā)現(xiàn),Apelin治療組的MVD計數明顯較其它各組為多(P<0.01)。
　　 6、Apelin對心肌缺血大鼠心肌結構的影響HE染色顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Apelin治療組的瘢痕形成較其它各組少。
　　 7、Apelin對心肌缺血大鼠VEGF和CD31表達的影響Western blot結果

14、顯示Apelin組(1μg/kg.d×7,腹腔注射)的VEGF和CD31蛋白表達明顯較其它各組為高。
　　 8、Apelin對HUVECs增殖的影響應用MTT觀察Apelin對HUVECs增殖的影響發(fā)現(xiàn),與其它各組梢比Apelin(Apelin 1umol/L)可以明顯的促進HUVECs的增值(P<0.01)。
　　 9、Apelin對HUVECs遷移的影響應用Transwell觀察Apelin對HUVECs遷移的影響發(fā)

15、現(xiàn),與其它各組相比Apelin(Apelin 1μg/ml)可以明顯的促進HUVECs的遷移(P<0.01)。
　　 10、Apelin對HUVECs血管形成的影響Tubeformation觀察Apelin對內皮細胞血管形成的影響發(fā)現(xiàn),Apelin(Apelin 60uM)治療組的小管形成的數目較其他各組為多(P<0.05)。
　　 11、盡管Apelin對缺血心肌和HUVECs有上述作用,但足在應用了PLC的抑制劑U-

16、73122以后,Apelin的心肌保護和心功能保護作用消失；在應用了mTOR的阻斷劑-雷帕霉素后,Apelin對心肌缺血側枝循環(huán)和對HUVECs促進增殖、遷移和血管形成的作用消失,與對照組無明顯差異(P>0.05)。
　　 結論
　　 1、Apelin可以保護心肌缺血的心臟損傷和心功能。
　　 2、Apelin保護心肌缺血的心臟損傷和增強心肌收縮力可能與激活細胞內的PLC信號通路有關。
　　 3、Apel