Urocortin抗大鼠心肌缺血-再灌注損傷及高血壓心臟重構(gòu)機(jī)制的研究.pdf

1、背景:優(yōu)洛可定(urocortin)是40個(gè)氨基酸的小分子肽，是CRF肽類家族的一個(gè)新成員，參與哺乳動(dòng)物應(yīng)激反應(yīng)的一種關(guān)鍵因子，除下丘腦外，它在中樞其它部位和外周組織中也發(fā)揮多方面作用。CRF肽類家族主要通過與相應(yīng)G-蛋白偶聯(lián)的CRF受體(CRF-R1，CRF-R2)相結(jié)合，調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)分泌、自律性以及對應(yīng)急的行為反應(yīng)等。Urocortin最早在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)發(fā)現(xiàn)，近年越來越多的研究表明urocortin可以通過自分泌和/或旁分泌方式與C

2、RF受體相結(jié)合在心血管系統(tǒng)發(fā)揮重要作用，并且它的這種心血管作用比CRF更顯著。有報(bào)道表明，urocortin能顯著而持久的降低動(dòng)脈血壓，增加動(dòng)脈血流量，升高心率，增加冠脈輸出。在體及離體實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在缺血-再灌注損傷、動(dòng)脈粥樣硬化以及高血壓等心血管病癥中，urocortin能保護(hù)心肌細(xì)胞免受損傷，起到心血管保護(hù)作用。Urocortin預(yù)處理可增強(qiáng)心肌抵抗力，其中最重要的途徑很可能是：urocortin與CRF-R2結(jié)合后直接調(diào)節(jié)PI-

3、3K，經(jīng)過Ras、Raf-1激活MEK1/2、ERK1/2-P42/44MAPK、PKC/KATP通道，后者通過磷酸化激活多種轉(zhuǎn)錄因子及降低氧自由基生成等一些現(xiàn)在尚不十分明確的途徑，發(fā)揮心血管保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)室在體實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，urocortin能顯著降低缺血-再灌注對大鼠心肌損傷。另外，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)urocortin能抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，這也提示urocortin有可能可以逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)，在高血壓等疾病中起心血管保護(hù)作用。

4、 目的: 1.研究urocortin通過降低氧化應(yīng)激反應(yīng)對缺血-再灌注損傷大鼠模型的保護(hù)作用機(jī)制； 2.通過研究urocortin對缺血-再灌注損傷大鼠模型超微結(jié)構(gòu)改變的影響，進(jìn)一步闡述其在缺血-再灌注損傷中的保護(hù)作用； 3.探討長期及亞急性應(yīng)用urocortin對自發(fā)性高血壓大鼠血流動(dòng)力學(xué)方面的改善作用以及對超微結(jié)構(gòu)改變的影響； 4.探討長期應(yīng)用urocortin對自發(fā)性高血壓大鼠心臟重構(gòu)的逆轉(zhuǎn)作用；

5、 5.研究urocortin對自發(fā)性高血壓大鼠、缺氧-再復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞膜L-型鈣通道、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。 方法: 1.SD系大鼠36只隨機(jī)分為6組(n=6)，包括：假手術(shù)組，對照組(缺血-再灌注損傷組，control)，UCN1，UCN2，UCN3以及維拉帕米組(VER)。除假手術(shù)組只開胸外，其余組大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支給予結(jié)扎30min，再灌注60min。在結(jié)扎前5min經(jīng)頸靜脈各組分別給予生理鹽水、uro

6、cortin(5μg/kg，10μg/kg，20μg/kg)或者維拉帕米(2mg/kg)。術(shù)中監(jiān)測心電圖，觀察心率、心律及S-T段改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取血清樣標(biāo)本用試劑盒測定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)以及一氧化氮(NO)含量以評價(jià)urocortin在氧化應(yīng)激中的作用。最后，用BI2000圖像分析系統(tǒng)測定心肌梗死面積。 2.另取36只SD系大鼠隨機(jī)分為6組(n

7、=6)，包括：假手術(shù)組、對照組、UCN1、UCN2、UCN3以及VER。除假手術(shù)組只開胸，其余組大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支給予結(jié)扎30min，再灌注60min。在結(jié)扎前5min經(jīng)頸靜脈各組分別給予生理鹽水、urocortin(5μg/kg，10μg/kg，20μg/kg)或者維拉帕米(2mg/kg)。每組取心臟在光鏡及透射電鏡下觀察病理及超微結(jié)構(gòu)改變，如線粒體、肌纖維、Z-線和鈣沉積等。 3.另取30只SD系大鼠，急性分離心肌細(xì)胞，并

8、給予缺氧-再復(fù)氧處理，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察urocortin對缺氧-再復(fù)氧心室肌細(xì)胞L-型鈣通道的影響。 4.取WKY大鼠6只作為空白對照組，另取自發(fā)性高血壓大鼠30只，隨機(jī)分成5組(n=6)，包括SHR對照組、UCN1、UCN2、UCN3、ENA組。Urocortin(1μgkg-1/d-1，3.5μgkg-1/d-1，7μgkg-1/d-1)經(jīng)尾靜脈注射8周，依那普利(10mgkg-1/d-1)灌胃8周。8周后，觀察各組

9、血流動(dòng)力學(xué)改變，之后測定各組心臟濕重，左心室取心肌標(biāo)本觀察病理及超微結(jié)構(gòu)變化。 5.WKY大鼠6只作為空白對照組，另取24周齡自發(fā)性高血壓大鼠36只。隨機(jī)分成6組(n=6)，包括SHR對照組、UCN1、UCN2、UCN3、VER組以及AST組。Urocortin(1μgkg-1/d-1，5μgkg-1/d-1，10μgkg-1/d-1)、維拉帕米(2mgkg-1/d-1)、AST(5μgkg-1/d-1)經(jīng)尾靜脈注射4d。經(jīng)頸靜

10、脈插管觀察亞急性應(yīng)用urocortin對高血壓大鼠血流動(dòng)力學(xué)影響以及對動(dòng)脈血壓波動(dòng)性影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，急性分離心肌細(xì)胞，一部分用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察urocortin對L-型鈣通道電流影響，另一部分心肌細(xì)胞用Furo-3熒光染色測定細(xì)胞內(nèi)熒光鈣含量。 結(jié)果: 1.與對照組比較，給予urocortin預(yù)處理的缺血-再灌注大鼠心律失常發(fā)生率及持續(xù)時(shí)間明顯降低，心肌梗死面積明顯縮小(P＜0.01)。 2.與對照組比較，

11、UCN組血清中SOD、GSH-PX以及NO含量顯著升高(P＜0.01)。 3.Urocortin可顯著降低大鼠血清中MDA、LDH活性，其作用呈劑量依賴性(P＜0.001)。 4.在缺血-再灌注模型對照組中，心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷明顯，線粒體腫脹、肌纖維斷裂、閏盤兩側(cè)有大量鈣沉積，UCN組中心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)顯著改善，線粒體排列整齊，鈣沉積較少。 5.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，urocortin能顯著抑制缺氧-再復(fù)氧損傷心室肌細(xì)胞L

12、-型鈣通道開放，減小L-型鈣通道電流。 6.長期給予urocortin能明顯改善自發(fā)性高血壓大鼠血流動(dòng)力學(xué)，降低左室收縮壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)、平均動(dòng)脈壓，顯著升高最大室壓變化率(+dp/dtmax，-dp/dtmax)及心率(P＜0.05)。 7.電鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，自發(fā)性高血壓大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，出現(xiàn)明顯心室重構(gòu)；長期應(yīng)用urocortin，超微結(jié)構(gòu)明顯改善，心室重構(gòu)被逆轉(zhuǎn)，作用效果與依那普利相近

13、似。 8.亞急性應(yīng)用(4d)urocortin發(fā)現(xiàn)，自發(fā)性高血壓大鼠血壓、LVSP、LVEDP、AMP顯著降低，心率以及±dp/dtmax明顯升高，此外urocortin能明顯降低動(dòng)脈血壓波動(dòng)性(P＜0.05)。 9.與自發(fā)性高血壓大鼠對照組比較，亞急性應(yīng)用urocortin使L-型鈣通道開放受抑制，同時(shí)流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，UCN組大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)熒光鈣含量明顯降低(P＜0.05)。 結(jié)論: 1.實(shí)驗(yàn)研究顯

14、示，缺血損傷前給予urocortin明顯降低心律失常發(fā)生率及減少心肌梗死面積，并且能顯著升高SOD、GSH-PX、NO含量，削弱MDA、LDH的活性。提示urocortin可能通過抑制自由基機(jī)制在缺血-再灌注損傷中起心肌保護(hù)作用。 2.Urocortin抑制急性分離的缺氧-再復(fù)氧大鼠心肌細(xì)胞L-鈣通道開放，減小鈣電流。 3.Urocortin能保護(hù)大鼠心肌細(xì)胞線粒體功能，保持其超微結(jié)構(gòu)完整性，在缺血-再灌注損傷中起心肌保

15、護(hù)作用。 4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，長期應(yīng)用urocortin能明顯改善自發(fā)性高血壓大鼠血流動(dòng)力學(xué)，改善心臟收縮及舒張功能。 5.長期應(yīng)用urocortin顯著改善自發(fā)性高血壓大鼠心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)、逆轉(zhuǎn)左心室的重構(gòu)，在高血壓中起到心肌保護(hù)作用。 6.亞急性應(yīng)用urocortin顯著改善自發(fā)性高血壓大鼠血流動(dòng)力學(xué)，并且能減少動(dòng)脈血壓波動(dòng)性，減輕高血壓遠(yuǎn)期靶器官損傷。 7.亞急性應(yīng)用urocortin能抑制急性分離