應(yīng)用SELDI-TOF-MS篩選子宮內(nèi)膜異位癥及子宮腺肌病在位內(nèi)膜線粒體差異蛋白的研究.pdf

1、子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMs)是生育年齡婦女常見的良性疾病，它又可浸潤病灶周圍的正常組織，治療后易于復(fù)發(fā)，具有一定的“惡性”行為，近年來發(fā)病率有逐年升高趨勢，成為婦科疾病中的熱點問題。內(nèi)異癥病因與發(fā)病機制至今未明，經(jīng)血逆流、種植以及腹膜或間皮細胞化生是兩種被廣泛接受的學說，其中以Sampson的經(jīng)血逆流種植學說為主導理論。經(jīng)血逆流是婦女月經(jīng)期常見的現(xiàn)象，可發(fā)生于80％-90％的月經(jīng)周期，但臨床上僅10％-15％育齡

2、婦女罹患內(nèi)異癥，這是Sampson學說無法解釋之處。新近的研究焦點聚焦于子宮在位內(nèi)膜，有謂“在位內(nèi)膜決定論”。有研究也表明內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜的一些生物因子表達異常，有別于正常子宮內(nèi)膜，使其具有更強的粘附和侵襲能力。
　　 約有30％的子宮內(nèi)膜異位癥患者同時合并子宮腺肌病(adenomyosis)，子宮腺肌病也是發(fā)生于女性生殖系統(tǒng)常見的良性病變，隨著診斷水平的提高，其發(fā)病率也呈上升趨勢。子宮腺肌病的發(fā)病機理尚未達成一致，其中被普遍

3、接受的假說是：子宮腺肌病起源于子宮內(nèi)膜基底層，由于某些特異性酶的作用，子宮肌層的平滑肌纖維束間失去緊密的連接，同時基底層內(nèi)陷，高水平雌孕激素刺激也可能是促進子宮內(nèi)膜向肌層生長的原因之一?？梢?，在位內(nèi)膜的侵襲性增強和肌層薄弱是子宮腺肌病形成的兩大重要要素。約15％的子宮腺肌病同時合并子宮內(nèi)膜異位癥，以往認為子宮腺肌病是內(nèi)在性的子宮內(nèi)膜異位癥，但研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)病機制和病理特點有別于外在性的子宮內(nèi)膜異位癥，故有的學者建議將子宮腺肌病作為一種獨立

4、性的疾病進行研究.
　　 子宮內(nèi)膜異位癥和子宮腺肌病的發(fā)病機制至今不明，診斷的金標準仍然依賴手術(shù)或病理檢查，因此臨床診斷困難，但其臨床癥狀和并發(fā)癥卻對女性健康和生育卻有著重大的影響。探討子宮內(nèi)膜異位癥和子宮腺肌病的發(fā)病機制，尋找微創(chuàng)、靈敏、特異的標志物成為基礎(chǔ)研究向應(yīng)用研究過渡的熱點之一。
　　 線粒體不僅是機體的能量代謝中心，而且還參與多種重要的細胞病理過程。線粒體也有可能成為癌癥和其他疾病早期篩查、風險評估和診斷的新

5、標志物，同時為尋找新的治療靶點和疾病干涉手段提供基礎(chǔ)。以往的研究中，子宮內(nèi)膜異位癥和子宮腺肌病的線粒體功能變化研究甚少，僅有少量研究表明，氧化應(yīng)激和線粒體DNA突變可能參與了內(nèi)異癥的發(fā)生和發(fā)展，而子宮內(nèi)膜異位癥和子宮腺肌病線粒體蛋白組學水平的研究，至今鮮有報道。
　　 蛋白質(zhì)而并非核酸才是生命活動的具體執(zhí)行者和體現(xiàn)者，因此深入研究子宮內(nèi)膜異位癥和子宮腺肌病的發(fā)病機制，尋找微創(chuàng)、特異、靈敏的標志物用于早期診斷和隨訪監(jiān)測，客觀上要求

6、在蛋白質(zhì)組的水平進行進一步探索。近年來開展的表面增強激光解吸-電離-飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)為這一探索提供了優(yōu)良的技術(shù)平臺。這一方法最大的優(yōu)勢在于高通量、高靈敏度的實現(xiàn)了質(zhì)譜技術(shù)對臨床樣本的直接檢測。
　　 本課題旨在應(yīng)用SELDI-TOF-MS和生物信息學技術(shù)從子宮在位內(nèi)膜中篩選子宮內(nèi)膜異位癥和子宮腺肌病的差異表達線粒體蛋白并構(gòu)建診斷模型；并將得到的線粒體差異蛋白與血清和內(nèi)膜總蛋白標志物進行對比，以期找到適

7、合子宮內(nèi)膜異位癥和子宮腺肌病早期診斷、監(jiān)測的候選標志物，為其分離、純化、解碼等進一步研究提供資源和基礎(chǔ)，為探索子宮內(nèi)膜異位癥和子宮腺肌病的發(fā)病機制和治療靶點提供新思路。
　　 第一部分：應(yīng)用SELDI-TOF-MS篩選子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜線粒體差異蛋白的研究
　　 目的：篩選子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜線粒體差異蛋白，并建立檢測模型。
　　 方法：采用SELDI-TOF-MS技術(shù)檢測24例內(nèi)異癥在位內(nèi)膜和29例對照患

8、者正常內(nèi)膜組織中線粒體蛋白，并用支持向量機方法建立判別模型，用留一法評估模型的預(yù)測效果：采用卡方檢驗檢驗各類模型間特異度和靈敏度的差異，t檢驗檢驗不同臨床分期間蛋白質(zhì)峰值表達差異。
　　 結(jié)果：1.內(nèi)異組在位內(nèi)膜/對照組正常內(nèi)膜組織間共檢測到線粒體蛋白質(zhì)峰78個，有統(tǒng)計學意義的差異蛋白質(zhì)峰10個(P＜0.05)，其中5，574 m/z和9，378 m/z兩個蛋白質(zhì)峰在內(nèi)異組中的表達低于對照組，其余8個蛋白質(zhì)峰在內(nèi)異組呈現(xiàn)高表達；

9、5，574、7，573和7，965m/z三個蛋白質(zhì)峰出現(xiàn)在增殖期，其它7個蛋白質(zhì)峰均出現(xiàn)在分泌期。
　　 2.3個線粒體蛋白質(zhì)峰（15，334，15，128和16，069 m/z）組合所構(gòu)建的診斷模型（模型1）鑒別內(nèi)異癥患者的特異度為86.2％，靈敏度為87.5％。
　　 3.分泌期內(nèi)異組在位內(nèi)膜/對照組正常內(nèi)膜組織間共檢測到線粒體蛋白質(zhì)峰69個，有統(tǒng)計學意義的差異蛋白質(zhì)峰14個(P＜0.05)，其中5，367、5，43

10、2、9，526和9，378 m/z4個蛋白質(zhì)峰在內(nèi)異組中的表達低于對照組，其余10個蛋白質(zhì)峰在內(nèi)異組呈現(xiàn)高表達。
　　 4.3個分泌期線粒體蛋白質(zhì)峰（7，615，5，432和15，868 m/z）組合所構(gòu)建的診斷模型（模型2）鑒別內(nèi)異癥患者的特異度為76.9％，靈敏度為80.0％，與模型1相比，無統(tǒng)計學差異。
　　 5.增殖期內(nèi)異組在位內(nèi)膜/對照組正常內(nèi)膜組織間共檢測到線粒體蛋白質(zhì)峰64個，均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)

11、。
　　 6.2個增殖期線粒體蛋白質(zhì)峰（3，456 m/z和15，128 m/z）組合所構(gòu)建的診斷模型（模型3）鑒別內(nèi)異患者的特異度為87.5％，靈敏度為85.7％。
　　 7.內(nèi)異組在位內(nèi)膜/對照組正常內(nèi)膜組織間檢測到的有統(tǒng)計學意義的10個線粒體差異蛋白質(zhì)峰中，處于Ⅲ、Ⅳ期的內(nèi)異癥患者15，334.15，128、7，573、15，868和7，982m/z五個蛋白質(zhì)峰值的表達水平顯著高于臨床分期Ⅰ、Ⅱ的患者(P＜0.05

12、)，5，574和9，378 m/z兩個峰值在Ⅲ、Ⅳ期的內(nèi)異癥患者的表達水平顯著低于臨床分期Ⅰ、Ⅱ的患者(P＜0.05）.另外3個蛋白質(zhì)峰值在不同的臨床分期中表達無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　 第二部分：應(yīng)用SELDI-TOF-MS篩選子宮腺肌病在位內(nèi)膜線粒體差異蛋白的研究
　　 目的：篩選子宮腺肌病在位內(nèi)膜線粒體差異蛋白，建立檢測模型，并將得到的線粒體差異蛋白與第一部分得到的子宮內(nèi)膜異位癥線粒體差異蛋白進行對比。<

13、br>　　 方法：采用SELDI-TOF-MS技術(shù)檢測13例子宮腺肌病在位內(nèi)膜和29例對照患者正常內(nèi)膜組織中線粒體蛋白，并用支持向量機方法建立判別模型，用留一法評估模型的預(yù)測效果。
　　 結(jié)果：1.腺肌病組在位內(nèi)膜/對照組正常內(nèi)膜組織間共檢測到線粒體蛋白質(zhì)峰82個，兩組間有統(tǒng)計學意義的差異蛋白質(zhì)峰1個。
　　 2.3個線粒體蛋白質(zhì)峰（7，614，14，978和6，370 m/z)組合所構(gòu)建的診斷模型鑒別子宮腺肌病患者的

14、特異度為93.1％，靈敏度為84.6％。
　　 3.14個線粒體蛋白質(zhì)峰同時出現(xiàn)在內(nèi)異組和腺肌病組，其中3，499m/z的峰在兩組中有統(tǒng)計學差異(P=0.029)，其余13個峰值在兩組中的表達無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)；3，384，3，499，4，237和5，388m/z的蛋白質(zhì)峰在內(nèi)異組和腺肌病組有相反的表達趨勢，其余10個峰值在兩組中有相同的表達趨勢。
　　 結(jié)論：
　　 1.子宮內(nèi)膜異位癥和子宮腺肌病患者

15、在位內(nèi)膜與對照組正常內(nèi)膜相比有差異表達的線粒體蛋白，在位子宮內(nèi)膜線粒體蛋白的變化可能與內(nèi)異癥和子宮腺肌病的發(fā)生有關(guān)。
　　 2.內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜與對照組正常內(nèi)膜相比大部分差異表達的線粒體蛋白質(zhì)峰出現(xiàn)在分泌期，分泌期內(nèi)膜線粒體蛋白可能在內(nèi)異癥形成過程中較增殖期內(nèi)膜線粒體蛋白發(fā)揮了更大的作用。
　　 3.在內(nèi)異癥中有差異表達的7個線粒體蛋白質(zhì)峰與內(nèi)異癥臨床分期有相關(guān)性，提示在位子宮內(nèi)膜線粒體蛋白的變化可能與內(nèi)異癥的發(fā)展、預(yù)

16、后有關(guān)。
　　 4.內(nèi)異癥在位內(nèi)膜線粒體差異蛋白與內(nèi)異癥血清蛋白標志物相比，無吻合的蛋白質(zhì)峰，可能是蛋白質(zhì)從細胞內(nèi)到血液循環(huán)的過程中經(jīng)過了修飾、剪接等過程，進而造成了分子量的改變。
　　 5.內(nèi)異癥在位內(nèi)膜線粒體差異蛋白與內(nèi)異癥在位內(nèi)膜總蛋白標志物相比較，有3個吻合的蛋白質(zhì)峰，對這些蛋白質(zhì)峰進行分離、純化和解碼是下一步的重要工作。
　　 6.組合線粒體蛋白標志物（15，334，15，128和16，069 m/z）