中國美利奴羊MHC-DRB1 exon2單倍型構(gòu)建及與布魯氏菌病易感性關(guān)聯(lián)性.pdf

1、目的：通過對中國美利奴羊MHC-DRB1exon2基因多態(tài)性進行研究，并構(gòu)建其單倍型，探討該基因SNPs與布魯氏菌病易感性相關(guān)性，初步篩選與布魯氏菌病易感性相關(guān)的單倍型。此研究的目的在于借鑒人類在疾病與HLA-DRB1多態(tài)性關(guān)系的研究中的經(jīng)驗，運用于OLA-DRB1基因SNPs與綿羊各種疾病的相關(guān)性分析上，這為利用標(biāo)記輔助選擇選育綿羊抗病新品種以及進一步研究MH C的抗病機理打一定前期基礎(chǔ)，為今后開展布魯氏菌抗性分子標(biāo)記輔助選擇研究提供

2、了一定的依據(jù)，為進一步定位具有易感性的遺傳位點而最終進行抗病育種奠定基礎(chǔ)。
　　方法：⑴運用虎紅平板凝集試驗對193個中國美利奴羊進行綿羊種布魯氏菌陽性血清檢測，然后采用PCR結(jié)合SSCP技術(shù)檢測其MHC-DRB1exon2的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，而后對不同等位基因進行克隆測序，運用分子生物學(xué)軟件進行比對分析，將檢測到的SNPs及單氨基酸多態(tài)性(SAPs)分別與人及其他不同品種綿羊的SNPs進行比較分析，再用SHEsis在線

3、軟件對每個SNP位點的等位基因頻率和基因型頻率進行差異統(tǒng)計分析，從而分析其與布魯氏菌病易感性的相關(guān)性。⑵采用PCR產(chǎn)物直接測序法對40例布魯氏菌陽性和陰性中國美利奴羊的MHC-DRB1exon2的SNPs進行檢測，然后對其進行Hardy-Weinberg平衡檢測及連鎖不平衡分析，而后運用SHEsis在線軟件對篩選的SNPs構(gòu)建單倍型并進行單倍型關(guān)聯(lián)分析，初步推測與布魯氏菌病易感性相關(guān)的單倍型。
　　結(jié)果：①虎紅平板凝集試驗檢測綿羊

4、種布魯氏菌陽性，在193個中國美利奴羊個體中檢出126個布魯氏菌陰性個體，其余的67個為陽性個體，布魯氏菌陽性檢出率為34.71％。②在中國美利奴羊MHC-DRB1exon2(270bp)的序列內(nèi)共檢測到41個SNPs，其中不存在插入和缺失位點，這些位點中包括9個簡約位點和32個單一多態(tài)位點。對其氨基酸序列進行分析，發(fā)現(xiàn)23個氨基酸多態(tài)位點。③對HLA-DRB1exon2的多態(tài)性進行分析，研究發(fā)現(xiàn)55個SNPs和36個SAPs，與中國美

5、利奴羊相比，僅有7個SNPs位點相同，其余均呈現(xiàn)不同，而且單氨基酸多態(tài)性較為豐富。④10個品種綿羊MHC-DRB1exon2的共有片段(270bp)進行序列比對分析，結(jié)果表明不同品種綿羊的SNPs位點及SAPs位點不盡相同。⑤在41個SNPs位點中，僅有109 C/T位點的等位基因在病例-對照樣本中的分布存在顯著差異(P<0.05)。針對每個SNP位點的基因型進行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)每個位點的基因型頻率在病例組和正常對照組中的分布不存在差異性

6、。⑥根據(jù)構(gòu)建單倍型所符合的條件，從檢測的SNPs位點中共篩選出29個符合條件，可用于連鎖不平衡分析和單倍型構(gòu)建。經(jīng)連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)中國美利奴羊MHC-DRB1exon2僅存在9個LD Block，且SNPs兩兩之間存在強連鎖不平衡，將其依次命名為Block1-Block9，但是發(fā)現(xiàn)每個LD Block內(nèi)的SNPs位點數(shù)卻各不相同，Block7包括A171G、G172C、A190G和G200T四個SNPs位點，而Block1、Block

7、3和Block4卻只有兩個SNPs位點組合而成。⑦經(jīng)單倍型分析，發(fā)現(xiàn)中國美利奴羊MHC-DRB1exon2上由篩選的29個SNPs位點，構(gòu)建了9種單倍型，根據(jù)這些單倍型在病例-對照組中的分布差異性，發(fā)現(xiàn)其中只有Hap8和Hap9兩種單倍型在病例和對照組中比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：⑴分析中國美利奴羊MHC-DRB1exon2多態(tài)位點，發(fā)現(xiàn)在270bp內(nèi)共檢測到41個多態(tài)位點，及23個氨基酸多態(tài)位點，充分說明該

8、序列的確存在豐富的SNPs和SAPs，表現(xiàn)為豐富多態(tài)性。⑵由于綿羊與人的MHC-DRB1exon2序列具有高度同源性，因而對 HLA-DRB1exon2的多態(tài)性進行分析，研究結(jié)果表明人MHC-DRB1exon2的SNPs和SAPs明顯比中國美利奴羊豐富復(fù)雜。⑶10個品種綿羊的MHC-DRB1exon2共有片段(270bp)進行序列比對分析，結(jié)果表明不同品種綿羊的SNPs位點及氨基酸變異位點不盡相同。⑷對中國美利奴羊MHC-DRB1exo

9、n2多態(tài)性與布魯氏菌病易感性的相關(guān)性研究，研究發(fā)現(xiàn)109 C/T可能與綿羊種布魯氏菌病易感性相關(guān)，而每個SNP位點的基因型可能與布魯氏易感性不相關(guān)，結(jié)果證實了DRB1基因有參與抗原遞呈。⑸由于兩兩之間存在連鎖不平衡，僅發(fā)現(xiàn)9個連鎖不平衡域，而且每個Block中的SNPs兩兩之間存在強連鎖不平衡。構(gòu)建了9種單倍型，根據(jù)這些單倍型在病例-對照組中的分布差異性，發(fā)現(xiàn)其中有兩種單倍型Hap8和Hap9與布魯氏菌病易感性的差異顯著(P<0.05)