中國(guó)美利奴細(xì)毛羊20號(hào)染色體MHC區(qū)段ClassⅡb延伸區(qū)域contig搭建.pdf

1、目的：綿羊是我國(guó)和世界上最有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的家養(yǎng)動(dòng)物之一。中國(guó)美利奴細(xì)毛羊更是我國(guó)優(yōu)良的種質(zhì)資源和經(jīng)濟(jì)物種。綿羊基因組主要組織相容性復(fù)合體（MHC），又叫綿羊白細(xì)胞抗原（Ovine Leukocyte Antigen, OLA），包含眾多緊密連鎖的免疫應(yīng)答和調(diào)控基因，這些基因與動(dòng)物抗病性以及疾病的易感性等密切相關(guān)。因此，對(duì)MHC區(qū)段的特征與功能研究至關(guān)重要。對(duì)該區(qū)段研究而中國(guó)美利奴細(xì)毛羊基因組BAC文庫(kù)已經(jīng)建好，并且MHC區(qū)段最小重疊度(Mi

2、nimal Tiling Path, MTP)物理圖譜已經(jīng)搭建好，并完成測(cè)序以及對(duì)該區(qū)段進(jìn)行了基因、重復(fù)序列以及microRNA等的預(yù)測(cè)，但是在MHC Class II a與MHC Class II b之間因?yàn)槿旧w倒位存在一個(gè)大的gap。而這個(gè)gap所在區(qū)段的遺傳連鎖研究表明，是由于常染色體片段倒位產(chǎn)生，它將MHC Class II區(qū)域分割成兩個(gè)不連續(xù)的區(qū)段：Class II a和Class II b。2009年4月牛的全基因組序列公

3、布，為綿羊基因組（特別是與牛相似的倒位區(qū)域）的研究提供了寶貴而豐富的資源。因此本研究的目的就是要根據(jù)牛的基因組序列和比較基因組學(xué)原理，利用PCR方法篩選中國(guó)美利奴細(xì)毛羊基因組BAC文庫(kù)，最終利用有效陽(yáng)性BAC克隆構(gòu)建綿羊基因組MHC Class II b延伸區(qū)域的MTP物理圖譜，為綿羊基因組MHC區(qū)段倒位區(qū)域MTP物理圖譜的一部分，進(jìn)一步推動(dòng)該倒位區(qū)域的研究，并推進(jìn)整個(gè)綿羊基因組MHC區(qū)段完整的MTP物理圖譜的構(gòu)建，為今后的對(duì)綿羊的基礎(chǔ)

4、研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：首先，通過(guò)比較基因組學(xué)方法，根據(jù)已公布的牛（Bos Taurus）的基因組序列，選擇位于BoLA Class II b延伸區(qū)域的一些有效Markers/Symbols，并據(jù)此設(shè)計(jì)引物。然后，利用PCR方法從已有的中國(guó)美利奴細(xì)毛羊基因組BAC文庫(kù)中篩選出候選的陽(yáng)性BAC克隆并進(jìn)行限制性酶切指紋圖譜分析(Fingerprinting Analysis)，搭建出初步的克隆重疊群（contig）；然后，對(duì)陽(yáng)性

5、BAC克隆進(jìn)行末端測(cè)序，并據(jù)此設(shè)計(jì)BAC末端引物，對(duì)克隆間的重疊關(guān)系進(jìn)行PCR確證，最終繪制出中國(guó)美利奴細(xì)毛羊OLA Class II b延伸區(qū)的MTP物理圖譜。
　　 結(jié)果：（1）根據(jù)牛的基因組圖譜，設(shè)計(jì)了26對(duì)用于文庫(kù)篩選的候選PCR引物，最終條件優(yōu)化好的可用于PCR篩選的引物為23對(duì)；（2）制備了已有基因組BAC文庫(kù)的一（初）級(jí)384孔板混合池和二（次）級(jí)行混合池；（3）通過(guò)PCR方法篩選出58個(gè)陽(yáng)性BAC克隆，并進(jìn)行了限

6、制性酶切指紋圖譜分析和克隆間重疊關(guān)系的PCR確證，最終選擇25個(gè)有效BAC克隆繪制出了OLA Class II b延伸區(qū)的MTP物理圖譜。
　　 結(jié)論：（1）利用牛的BoLA Class II b延伸區(qū)的一些Markers/Symbols，通過(guò)PCR方法能篩選出陽(yáng)性BAC克隆，不僅說(shuō)明綿羊與牛在該區(qū)域的基因組序列同源性很高，而且證明運(yùn)用PCR方法進(jìn)行基因組BAC文庫(kù)篩選是快速而行之有效的。（2）在本研究中有3對(duì)根據(jù)牛的基因組序列