殼聚糖-聚乙二醇琥珀酸酯絲裂霉素C釋藥系統(tǒng)的系列實驗研究.pdf

1、椎板切除或開窗為脊柱外科常用的手術方法之一。在椎板切除術后，硬膜外瘢痕組織向椎管內擠壓，牽拉硬脊膜及神經根等病理過程是產生脊椎術后失敗癥候群的重要原因。脊椎術后失敗癥候群，并不全然是指手術本身失敗而言，在學術研究上更包括了凡是脊椎手術后癥狀仍然持續(xù)，或者再度發(fā)生新的癥狀之病癥。另外，也包括其他未經手術的脊椎新的退化性椎間盤疾病，均統(tǒng)稱脊椎術后失敗癥候群。而脊椎術后失敗癥候群的病人，通常在手術后仍然持續(xù)出現背痛、坐骨神經痛，甚至造成功能障

2、礙等癥狀。在眾多造成脊椎術后失敗癥候群之原因中，脊椎術后瘢痕組織的形成可視為一個重要的原因。脊椎術后瘢痕組織主要是由于手術中受到創(chuàng)傷的骨膜和脊旁肌群中的纖維母細胞侵入術后所殘留的血塊中，經過一段時間逐漸轉化而成脊椎術后瘢痕組織，瘢痕組織沿著術后椎板缺口進入脊柱管腔內，并與脊椎管腔內的神經組織形成粘連，而此粘連不僅使得與之粘連的脊椎硬腦膜出現增厚，同時亦使馬尾內的神經根產生病理性變化，嚴重影響脊柱外科手術的遠期效果，而且給再次手術帶來困難

3、。這勢必會延長治療時間，增加患者的傷痛。因此，如何有效地預防術后硬膜外瘢痕粘連是脊柱外科領域亟待解決的課題。近年來，國內外學者在基礎實驗和臨床實踐方面進行了大量的研究，取得了一定的進展。為此，我們與華南農業(yè)大學制藥工程系合作研制一種新型的載藥緩釋膜片系統(tǒng)，并經以下系列實驗研究證明：這一新型緩釋膜片系統(tǒng)具有良好的生物相容性，可在局部緩釋絲裂霉素，有效地抑制脊柱術后硬膜外瘢痕的增生。實驗分三個部分進行觀察研究： 課題研究第一部分：殼

4、聚糖/聚乙二醇琥珀酸酯薄膜釋藥系統(tǒng)的制備及其與肌成纖維細胞生物相容性的研究。 目的：制備防粘連殼聚糖/聚乙二醇琥珀酸酯薄膜并觀察其在體外與肌成纖維細胞的生物相容性。 方法：實驗于2006-05/12在南方醫(yī)科大學附屬珠江醫(yī)院中心實驗室完成。實驗材料：在透析后的殼聚糖與聚乙二醇琥珀酸酯或聚乙二醇共混后置入凍干機凍干制得殼聚糖/聚乙二醇琥珀酸酯薄膜或殼聚糖/聚乙二醇膜，并將新生2～5 d的SD大鼠骨骼肌成纖維細胞種植于膜片上

5、。實驗評估：①MTT法測定肌成纖維細胞接種在不同膜片上12h的吸光光度值，計算相對貼附率。相對貼附率=不同膜的A<,490nm>/培養(yǎng)板的A<,490nm>×100％。②MTT法測定肌成纖維細胞在不同膜片上的生長1，3，5 d后的吸光光度值。⑧相差顯微鏡下觀察肌成纖維細胞的生長形貌。應用SPSSl．3．0軟件對細胞貼附率結果行單項方差分析及LSD法兩兩比較和對細胞生長情況行重復測量方差分析(α=0.05)。 結果：①肌成纖維細胞

6、在不同膜片上的貼附率：肌成纖維細胞在殼聚糖/聚乙二醇琥珀酸酯薄膜上能良好粘附、增殖，而在殼聚糖/聚乙二醇膜、殼聚糖膜上粘附性差。聯合培養(yǎng)12 h，5 d后MTT法結果顯示，殼聚糖/聚乙二醇琥珀酸酯組的A值分別為0.074±0.009，0.141±0.031，分別為殼聚糖組的6.17倍和6.13倍(P=0.000)。②肌成纖維細胞的生長特性：肌成纖維細胞在殼聚糖/聚乙二醇琥珀酸酯膜上的活性最高，增殖能力最強，增長速度最快，其次為殼聚糖/聚

7、乙二醇膜，但兩者比較差異有顯著性意義(P=0.046)，而細胞在殼聚糖膜上的增殖能力較低，膜上細胞數目較少，與其他組比較差異有顯著性意義(P=0.000)。⑧肌成纖維細胞與不同膜片聯合培養(yǎng)1，3，5 d時的生長形貌：殼聚糖膜上細胞未貼壁生長，為透明的圓球形，呈游離狀態(tài)，未能很好舒展，且有些皺縮，生長活力也不旺盛；細胞與殼聚糖/聚乙二醇膜、殼聚糖/聚乙二醇琥珀酸酯膜片聯合培養(yǎng)的生長情況要明顯好于殼聚糖膜，細胞相互融合成片，多呈長梭形，細胞

8、間隙狹窄，緊密排列成束，成指紋狀結構且聚集生長的趨勢也更明顯。 結論：將接支琥珀?；木垡叶寂c殼聚糖共混組成的網狀系統(tǒng)改進了膜片的力學性能，提高了膜片的柔韌性，使其成膜性更好；殼聚糖/聚乙二醇琥珀酸酯薄膜具有良好的生物相容性，肌成纖維細胞在殼聚糖/聚乙二醇琥珀酸酯薄膜上的粘附及生長情況明顯好于殼聚糖薄膜。 課題研究第二部分：殼聚糖/聚乙二醇琥珀酸酯絲裂霉素C釋藥系統(tǒng)的研制與體外釋放實驗 目的：研制殼聚糖/聚乙二

9、醇琥珀酸酯(Chitosan-Polyethlyeneglycols-Succinate，CH/PEG-SA)絲裂霉素C(Mitomytin C,MMC)局部藥物釋放系統(tǒng)，觀察其體外釋藥效果。 方法：體外釋藥測定藥物釋放濃度與時間的變化曲線，探討膜片結構與釋藥的關聯性。實驗數據應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理，用回歸分析和曲線擬合絲裂霉素C標準品濃度與紫外吸收光度值的標準曲線，建立回歸方程。 結果：根據實驗結果繪制的絲裂

10、霉素C標準曲線，曲線回歸方程為：y=0.593x<'3>-2.563x<'2>+25.944x-0.236，確定系數為1.000。藥物緩釋膜片3個試樣中絲裂霉素C均能從膜片向PBS液中擴散，具有明顯緩釋作用。釋放量逐漸增加，于第12天時維持釋放量達最大，為14.9616μg/mL，其后又于第18天和第32天時出現兩次釋放高峰，分別為14.4824μg/mL和11.4092μg/mL，其余時間以較低濃度間斷釋放維持，且釋放量逐漸減少，于第

11、60天時三周累積釋放量仍有0.179μg/mL的釋放量，明顯高于成纖維細胞．50％抑制率質量濃度(ID<,50>，10.4713μg/mL)。 結論：該膜片之所以能保持長時間的藥物釋放，與它的結構有關：CH/PEG-SA是在聚乙二醇的末端接支共聚琥珀酸，通過在聚乙二醇末端的羥基上引入羰基和羧基：HO-(CH<,2>CH<,2>O)n-H(聚乙二醇)+HOOCCH<,2>CH<,2>COOH(琥珀酸)→HOOC CH<,2>CH<

12、,2>COO-(CH<,2O)n-OCCH<,2>CH<,2>COOH。而MMC本身又有3個羰基結構，利用羰基和羧基與殼聚糖分子中氨基間的分子作用力，既提高膜片的柔韌性，又改善復合材料的力學性能，使其成膜性更好，釋放性能更顯著，能更有效地避免藥物突釋，保持長時間的藥物釋放。 課題研究第三部分：殼聚糖/聚乙二醇琥珀酸酯絲裂霉素C薄膜釋藥系統(tǒng)預防SD大鼠椎板切除術后硬膜外瘢痕粘連形成的實驗研究 目的：研究殼聚糖

13、/聚乙二醇琥珀酸酯絲裂霉素C薄膜釋藥系統(tǒng)對硬膜外瘢痕粘連的治療作用。 方法：SD大鼠30只，隨機分為6組，每組5只。選用SD大鼠制作腰椎椎板切除模型，將30只SD大鼠稱重，按體重大小順序編號，按隨機數目表法隨機分為Ⅰ～Ⅵ組。Ⅰ組植入20mg CH膜片；Ⅱ組植入20mg CH/PEG膜片；Ⅲ組植入20mg CH/PEG-SA膜片；Ⅳ組用濃度為0.05mg/mLMMC溶液浸潤5min；Ⅴ組植入20mg CH/PEG-SA/MMC膜片

14、；Ⅵ組無任何植入。治療術后4周取材，通過免疫組化、組織學檢查觀察比較硬膜外瘢痕的增生情況，應用SPSS13.0軟件對大體觀察結果行多個獨立樣本非參數(Kruskal WaUis Test)檢驗(α=0.05)；對免疫組化檢驗結果單項方差分析(one-way ANOVA)及LSD法，以P<0.05為具有顯著性差異，比較上述各組方法對硬膜外瘢痕的治療作用。 結果：不同組膜片對硬膜外瘢痕粘連的大體觀察療效差異有顯著性意義(x<'2>=

15、24.120、P=0.000)。不同膜片組硬膜外瘢痕組織中羥脯氨酸含量比較有顯著性差異(F=12.085、P=9.000)，Ⅰ～Ⅴ組羥脯氨酸含量均低于Ⅵ組，有顯著性差異(P值分別為0.001、0.017、0.000、0.000、0.000)，說明各組均有抑制瘢痕組織增生的作用；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組三組比較，羥脯氨酸含量無顯著性差異(P值分別為0.177、0.880、0.136)，說明三組膜片對硬膜外瘢痕組織的抑制作用相當；Ⅳ、Ⅴ組兩組比較，羥脯

16、氨酸含量無顯著性差異(P=0.654)，但與Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組比較均有顯著性差異(其中與Ⅳ組比較P值分別為0.032、0.001、0.045，與Ⅴ組比較P值分別為0.012、0.000、0.017)，說明該CH/PEG-SA/MMC膜釋藥系統(tǒng)與單獨用絲裂霉素C在抑制瘢痕的量上無顯著差別，但兩者的效果均好于其他組。 結論：①在椎板切除后，將CH/PEG-SA/MMC膜片植入椎板缺損處，能有效地減少硬膜外瘢痕中羥脯氨酸(Hyp)的含量，且

17、可以長期釋放少劑量MMC，是抑制椎板切除術后硬膜外瘢痕粘連的理想方法，能達到減毒增效的作用。②傳統(tǒng)的單純局部應用MMC方法雖然較對照組好且與CH/PEG-SA/MMC膜無顯著性差異，但不能確保長期有效治療硬膜外瘢痕，且無法控制其短時間大劑量使用時本身的毒副作用。③單純局部應用CH膜片僅起到機械屏障作用，有限地阻隔椎板后方瘢痕組織的侵入，但無法阻止炎癥過程中成纖維細胞向創(chuàng)口內聚集、增殖、合成、分泌膠原纖維并形成瘢痕組織。 綜上所述