WIF1在膽囊癌中恢復(fù)表達(dá)可抑制腫瘤生長并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡以及可調(diào)控EpCAM等蛋白質(zhì)的表達(dá).pdf

1、研究背景：
　　膽囊癌發(fā)病率在消化道惡性腫瘤中位居第五位,是膽道系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。早期診斷、早期治療是目前唯一治愈膽囊癌的有效手段,但是多數(shù)患者就醫(yī)時(shí),已處于晚期,無法接受手術(shù)。影響膽囊癌患者預(yù)后的主要原因有膽囊癌發(fā)展迅速,易侵犯周圍臟器發(fā)生轉(zhuǎn)移等。因此對(duì)膽囊癌生長侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制方面的研究,尋找控制膽囊癌侵襲轉(zhuǎn)移的治療方法對(duì)提高膽囊癌患者生存期具有重要意義。
　　Wnt信號(hào)通路作為體內(nèi)高度保守的代謝通路,廣泛參與了胚胎分化

2、,細(xì)胞增殖等總要過程,正常細(xì)胞內(nèi)此通路一般處于關(guān)閉狀態(tài),而它的異常激活,往往與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。以往的研究表明部分腫瘤中,WIF-1作為Wnt代謝通路的抑制因子之一,可通過阻斷Wnt通路從而抑制腫瘤的生長。但是WIF-1在膽囊癌中的表達(dá)情況以及對(duì)于膽囊癌的生物學(xué)行為的影響以及其作用機(jī)制目前仍尚無報(bào)道。
　　本研究在相關(guān)前期文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的基礎(chǔ)上首次探討WIF-1基因在膽囊癌的表達(dá)及其臨床、病理和預(yù)后意義;研究其在膽囊癌增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移

3、等過程中的作用;構(gòu)建裸鼠膽囊癌原位移植瘤模型;研究WIF-1對(duì)于Wnt代謝通路蛋白質(zhì)表達(dá)及膽囊癌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響。從而深化對(duì)膽囊癌發(fā)病和進(jìn)展機(jī)制的了解,探索膽囊癌新的治療靶點(diǎn)。
　　第一部分:WIF-1在膽囊癌中的表達(dá)及其臨床病理和預(yù)后意義
　　目的:本研究旨在探討WIF-1的表達(dá)與膽囊癌的臨床病理特點(diǎn)及預(yù)后的關(guān)系。
　　方法:用免疫組化評(píng)價(jià)WIF-1蛋白在40例膽囊癌以及45例慢性膽囊炎中的表達(dá)情況,結(jié)合臨床數(shù)據(jù)進(jìn)

4、行分析。采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn),WIF-1表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系用四格表確切概率法,P<0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:WIF-1在40例膽囊癌標(biāo)本中,僅9例WIF-1表達(dá)陽性,表達(dá)率為22.5％(9/40),而在45例膽囊炎中,WIF1的表達(dá)率為100%(45/45),兩者之間的陽性率具有顯著差異性(P<0.001)。膽囊癌組織中WIF-1基因表達(dá)與年齡、性別、腫瘤大小、有無伴有膽

5、囊結(jié)石、組織學(xué)類型、分化程度等臨床病理學(xué)資料均未見相關(guān)性(P>0.05),提示W(wǎng)IF-1的缺失表達(dá)可能是膽囊癌發(fā)生過程中的早期事件。
　　第二部分:WIF-1基因在膽囊癌細(xì)胞中表達(dá)情況及WIF-1過表達(dá)膽囊癌細(xì)胞株的構(gòu)建鑒定
　　目的:檢測(cè)WIF-1在三株膽囊癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況并初步探討造成這種情況的原因:進(jìn)而構(gòu)建過表達(dá)WIF-1膽囊癌GBC-SD細(xì)胞株,并對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)WIF-1mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)變化情況。
　　方

6、法:采用RTPCR、Western-Blot、啟動(dòng)子甲基化特異性PCR技術(shù)分析GBC-SD、NOZ以及SGC-996三株細(xì)胞WIF-1mRNA、WIF-1蛋白及WIF-1基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài);并通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD,應(yīng)用RT-PCR及Weatern-Blot技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后人膽囊癌細(xì)胞GBC-SD的WIF-1的mRNA及蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:GBC-SD、NOZ、SGC-996細(xì)胞系中WIF-1均缺失表達(dá),三株細(xì)

7、胞中WIF-1啟動(dòng)子區(qū)域均存在甲基化狀況,這可能是造成WIF-1在三株細(xì)胞中缺失表達(dá)的原因。過表達(dá)WIF-1質(zhì)粒作用于人膽囊癌細(xì)胞株GBC-SD后,WIF-1的mRNA表達(dá)恢復(fù),WIF-1蛋白表達(dá)恢復(fù)。
　　第三部分:過表達(dá)WIF-1基因?qū)θ四懩野┘?xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及凋亡能力的影響
　　目的:研究過表達(dá)WIF-1基因?qū)θ四懩野┘?xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及凋亡能力的影響。
　　方法:膽囊癌GBC-SD細(xì)胞分為三組:GBC-S

8、D未處理組,GBC-SD空質(zhì)粒組(GBC-SD-MOCK)以及GBC-SD過表達(dá)組(GBC-SD-WIF-1)。CCK-8法檢測(cè)三組細(xì)胞增殖能力;Transwell小室運(yùn)動(dòng)侵襲試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力;流式細(xì)胞儀檢測(cè)WIF-1誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡能力;明膠酶譜法檢測(cè)細(xì)胞上清MMPs分泌變化情況。
　　結(jié)果:過表達(dá)WIF-1基因能抑制GBC-SD細(xì)胞增殖、遷移及侵襲,并可促進(jìn)GBC-SD細(xì)胞凋亡(P<0.01)?？召|(zhì)粒組及未處理組細(xì)胞

9、間增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移凋亡能力無明顯差異(P>0.05)。過表達(dá)WIF-1能抑制MMP-2及MMP-9的分泌(P<0.01),GBC-SD-MOCK組及GBC-SD組分泌MMP2,9能力無明顯差異(P>0.05)。
　　第四部分:過表達(dá)WIF-1基因?qū)θ四懩野┘?xì)胞裸鼠皮下移植瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的影響
　　目的:研究過表達(dá)WIF-1基因?qū)θ四懩野┘?xì)胞裸鼠皮下移植瘤生長侵襲的影響。
　　方法:膽囊癌GBC-SD細(xì)胞分為三組:GBC-

10、SD未處理組,GBC-SD空質(zhì)粒組(GBC-SD-MOCK)以及GBC-SD過表達(dá)組(GBC-SD-WIF-1),15只裸鼠隨機(jī)分為3組,每組5只。收集對(duì)數(shù)生長期的三組細(xì)胞,注射100μl,1×106細(xì)胞/鼠細(xì)胞懸液于實(shí)驗(yàn)裸鼠左前腋皮下,觀察五周后處死裸鼠,測(cè)量稱重體積,收集標(biāo)本制做病理切片。
　　結(jié)果:3組裸鼠成瘤率100%,過表達(dá)WIF-1組裸鼠腫瘤生長速度及成瘤體積重量均明顯小于其余2組(P<0.001);空質(zhì)粒組及未處理陰

11、性組成瘤無明顯差異(P>0.05);三組細(xì)胞成瘤均未見腹腔轉(zhuǎn)移及肝臟轉(zhuǎn)移,表明過表達(dá)WIF-1基因抑制人膽囊癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生長轉(zhuǎn)移。
　　第五部分過表達(dá)WIF-1對(duì)于下游蛋白質(zhì)的調(diào)控以及細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)的影響
　　目的:研究過表達(dá)WIF-1對(duì)于GBC-SD細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響,分析WIF-1對(duì)于WNT代謝通路的作用機(jī)制及觀察過表達(dá)WIF-1蛋白的GBC-SD細(xì)胞系超微結(jié)構(gòu)變化。
　　方法:采用Raybiotech蛋白芯

12、片半定量檢查過表達(dá)WIF-1蛋白的GBC-SD細(xì)胞系內(nèi)部分蛋白質(zhì)表達(dá)變化;采用掃描電鏡觀察其GBC-SD-WIF-1、GBC-SD-MOCK、GBC-SD三株細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。
　　結(jié)果:WIF-1可導(dǎo)致EpCAM等多種蛋白質(zhì)的表達(dá)發(fā)生上調(diào)或下降,這些蛋白質(zhì)參與了細(xì)胞內(nèi)諸多重要生理病理過程,提示W(wǎng)IF-1可能通過調(diào)節(jié)這些蛋白質(zhì)的表達(dá)而參與了腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)化過程;掃描電鏡結(jié)果提示GBC-SD-WIF-1細(xì)胞內(nèi)溶酶體分泌顯著增多,而

13、GBC-SD細(xì)胞與GBC-SD-MOCK細(xì)胞內(nèi)則未見這一變化。
　　結(jié)論：
　　1、多數(shù)膽囊癌組織中缺失表達(dá)WIF-1,WIF-1表達(dá)情況與腫瘤大小、分化程度和TNM分期無明顯相關(guān),表明WIF-1的失活可能為膽囊癌發(fā)生發(fā)展過程中的早期事件。
　　2、膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD、NOZ-996及SGC-996三株細(xì)胞系中WIF-1 mRNA均缺失表達(dá),不表達(dá)WIF-1蛋白,這可能與其啟動(dòng)子區(qū)域存在甲基化相關(guān);構(gòu)建過表達(dá)WI

14、F-1質(zhì)粒作用于人膽囊癌細(xì)胞株GBC-SD后,WIF-1 mRNA表達(dá)恢復(fù),WIF-1蛋白表達(dá)恢復(fù)。
　　3、過表達(dá)WIF-1基因能抑制GBC-SD細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力,并可促進(jìn)GBC-SD細(xì)胞凋亡,與之相對(duì)應(yīng)MMP2,9在過表達(dá)WIF-1蛋白GBC-SD細(xì)胞中表達(dá)降低,證明了WIF-1對(duì)于GBC-SD的侵襲轉(zhuǎn)移具有抑制效應(yīng)可能與MMPs分泌相關(guān)。
　　4、人膽囊癌細(xì)胞GBC-SD皮下接種裸鼠可產(chǎn)生移植瘤;過表達(dá)WIF-