光皮樺BlKNOX家族基因表達(dá)及互作機(jī)制分析.pdf

1、KNOX同源異型結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子在植物發(fā)育過(guò)程中起重要調(diào)控作用?；谛蛄邢嗨菩?KNOX蛋白被分為 KNOXI和 KNOXII兩個(gè)亞家族。KNOXI基因在頂端分生組織中表達(dá),決定分生組織細(xì)胞命運(yùn),并在側(cè)生器官的形成和發(fā)育過(guò)程中起調(diào)控作用;KNOXII基因的表達(dá)模式多樣化但目前對(duì)其功能知之甚少。已有的研究表明 KNOXII基因參與調(diào)控次生細(xì)胞壁、木質(zhì)部和根等的形成。在植物體內(nèi),KNOX蛋白通過(guò)調(diào)控其靶標(biāo)基因進(jìn)而調(diào)控激素在分生組織中的體內(nèi)平衡

2、,同時(shí)它和另一個(gè)同源異形域BELL亞家族蛋白形成異源二聚體,最終達(dá)到調(diào)控赤霉素和木質(zhì)素的生物合成途徑,從而決定細(xì)胞命運(yùn)。本研究以光皮樺為材料,進(jìn)行了 KNOX基因家族的克隆,表達(dá)分析和互作蛋白篩選等工作,對(duì) KNOX蛋白的互作機(jī)制進(jìn)行了探索,主要獲得以下結(jié)果:
　　1.基于轉(zhuǎn)錄組序列采用 RACE的方法從光皮樺(Betula luminifera H.Wink.)克隆到5個(gè) KNOX基因,命名為 BlKNOX1-BlKNOX5。通

3、過(guò) Blast對(duì)分析光皮樺 KNOX基因結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析,分析表明,這5個(gè)基因?qū)儆诘湫偷?KNOX基因家族,其編碼的蛋白包含KNOXA、KNOXB、ELK、HD結(jié)構(gòu)域。序列分析顯示BlKNOX1,3,4屬于 KNOXI,BlKNOX2,5屬于 KNOXII。同時(shí)采用實(shí)時(shí)定量 PCR的方法對(duì)其進(jìn)行了表達(dá)分析,結(jié)果表明 BlKNOX2,5主要在葉中表達(dá),且隨著葉片的發(fā)育呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì),表達(dá)量在未成熟葉中達(dá)到最大值;BlKNOX1,3,4在

4、莖中表達(dá)量最高, BlKNOX1隨著木質(zhì)化程度的加深,其表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì),而 BlKNOX3,4隨著木質(zhì)化程度的加深,其表達(dá)量呈逐漸上升的趨勢(shì)。
　　2.構(gòu)建誘餌載體 pGBKT7-BlKNOXs,將其轉(zhuǎn)化酵母 Y2HGold細(xì)胞檢測(cè)其細(xì)胞毒性和自激活作用。檢測(cè)結(jié)果表明 pGBKT7-BlKNOX2,4,5無(wú)自激活活性,而其余兩個(gè)有自激活活性。為了了解 BlKNOX1,3自激活作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域,將BlKNOX1,3構(gòu)建成不同

5、的截短體誘餌載體,并檢測(cè)自激活活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn), BlKNOX1的四個(gè)截短體都沒(méi)有自激活活性,說(shuō)明基因結(jié)構(gòu)的完整性對(duì) BlKNOX1誘餌載體是否有自激活作用起決定作用;而 BlKNOX3的 N端蛋白對(duì)酵母 Y2HGold有毒性, KNOXB可能是 BlKNOX3是否有自激活作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域, N端和KNOXA結(jié)構(gòu)域的存在對(duì)自激活起增強(qiáng)作用。
　　3.構(gòu)建光皮樺酵母雙雜交文庫(kù),文庫(kù)檢測(cè)結(jié)果顯示,根據(jù)生長(zhǎng)菌落計(jì)數(shù),文庫(kù)含有7.5×107

6、轉(zhuǎn)化子,隨機(jī)挑取46個(gè)克隆進(jìn)行 PCR檢測(cè),插入片段長(zhǎng)度集中在0.4~3Kb之間,表明該文庫(kù)達(dá)到建庫(kù)要求,為下一步進(jìn)行酵母雙雜交試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　4.構(gòu)建七個(gè)BlBELs的獵物載體,在酵母中檢測(cè)BlBELs與BlKNOXs的相互作用,結(jié)果表明:BlBELs和 BlKNOX2,4,5在酵母雙雜交中,除了 BlBEL1和BlKNOX2沒(méi)有相互作用外,其余的都檢測(cè)到了發(fā)生相互作用,但是強(qiáng)弱有差異。光皮樺中的 TALE家族的 BEL蛋白

7、和 KNOX蛋白可能以異聚體的形式起調(diào)控作用。同時(shí)對(duì) BlBELs與 BlKNOXs做了表達(dá)分析,結(jié)果表明:BlKNOX2,5和BlBEL6,7在葉片的發(fā)育過(guò)程中表達(dá)量上調(diào),說(shuō)明 BlKNOX2,5和 BlBEL6,7可能以異源二聚或多聚體的形勢(shì)參與葉片發(fā)育過(guò)程的調(diào)控。BlKNOX1,2,5和 BlBEL2,6,7在發(fā)育中的雌花中的表達(dá)量上調(diào),推測(cè) BlKNOX1,2,5和 BlBEL2,6,7通過(guò)相互作用共同參與雌花發(fā)育過(guò)程的調(diào)控。<

8、br>　　5.選取 pGBKT7-BlKNOX2與光皮樺酵母文庫(kù)進(jìn)行雙雜交,通過(guò) AbA、X-α-Gal和營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基來(lái)篩選陽(yáng)性克隆。提取223個(gè)陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌擴(kuò)繁后測(cè)序,并把測(cè)序結(jié)果在 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比對(duì),最終確定25個(gè)與其相互作用的蛋白,分別為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、肽酶、殼多糖酶。這些結(jié)果為揭示光皮樺KNOX基因的功能與調(diào)控機(jī)制提供了基礎(chǔ)。同時(shí)對(duì)BlKNOX2和篩選得到的序列進(jìn)行表達(dá)分析,結(jié)果表明:BlKNOX