栽培稻及疣粒野生稻中Xa5等位基因的功能研究.pdf

1、水稻白葉枯病是由黃單胞水稻變種引起的細(xì)菌性維管束病害，嚴(yán)重影響著水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)。挖掘新的抗性基因，培育新的抗病品種是目前控制病害發(fā)生最經(jīng)濟(jì)有效的措施。
　　對(duì)植物抗性基因的研究一直以來是植物分子生物學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)，迄今從不同宿主中分離出的多個(gè)抗性基因中僅有少部分為隱性抗性基因，這些隱性抗性基因的具體作用機(jī)理目前尚不能用廣為接受的顯性抗性基因的作用機(jī)理來進(jìn)行解釋。
　　從水稻中已鑒定出了38個(gè)主效抗白葉枯病基因，已被定位的有2

2、7個(gè)，其中僅有5個(gè)為隱性抗性基因。位于第5號(hào)染色體短臂的xa5是其中典型的一個(gè)隱性抗性基因，編碼轉(zhuǎn)錄因子ⅡAγ小亞基，和其它顯性或者隱性抗白葉枯病基因存在抗性互作，基因結(jié)構(gòu)和其它典型抗性基因的結(jié)構(gòu)都不一樣，說明了xa5基因抗病機(jī)理的特異性。
　　xa5的序列在水稻抗病品種和感病品種中有兩個(gè)堿基的差異導(dǎo)致了纈氨酸突變成谷氨酸，而且該突變的氨基酸位點(diǎn)位于蛋白三維結(jié)構(gòu)的表面，可能與蛋白的互作相關(guān)。
　　1.OsXa5和OmXa5基

3、因的表達(dá)特性
　　分別構(gòu)建OsXa5和OmXa5基因的亞細(xì)胞定位的載體和自身互作載體，通過農(nóng)桿菌共浸潤的方法，在煙草體細(xì)胞中觀察到OsXa5和OmXa5均為核內(nèi)定位的基因，未觀察到兩者存在自身互作的現(xiàn)象。為進(jìn)一步了解基因在水稻植株中的表達(dá)，分別取野生型石狩白毛4個(gè)不同生育期的根、莖和葉片，通過半定量PCR檢測基因出基因在水稻的全生育期均有表達(dá)，且以在最大分蘗期的葉片中表達(dá)量最大。水稻野生型石狩白毛2h和24 h后通過半定量PCR檢

4、測基因的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)兩個(gè)不同處理時(shí)間段基因的表達(dá)量差異不顯著。但在乙烯、干旱和高溫脅迫處理水稻植株24 h后，基因的表達(dá)量與2h的處理組相比略有變化，推測OsXa5基因可能參與了植物體應(yīng)對(duì)乙烯和干旱脅迫的應(yīng)答途徑，且基因的表達(dá)還受到高溫脅迫的影響。
　　2.OsXa5和OmXa5抗病性鑒定及轉(zhuǎn)錄組研究
　　超表達(dá)目的基因并通過基因工程將其導(dǎo)入水稻等模式作物中已成為研究基因功能的重要方法。將OsXa5和OmXa5基因超表達(dá)后

5、，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入野生型石狩白毛的愈傷組織中，借助PCR檢測法和卡方檢驗(yàn)篩選獲得OsXa5和OmXa5的純合超表達(dá)水稻植株OsXa5-OE和OmXa5-OE。
　　對(duì)超表達(dá)植株種子的萌發(fā)狀況進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，與野生型石狩白毛相比，OsXa5-OE的種子萌發(fā)率的差異不顯著，而OmXa5-OE種子的萌發(fā)率較低;對(duì)生理表型特征的觀察，發(fā)現(xiàn)OsXa5-OE平均每株苗的葉片數(shù)目較少，OmXa5-OE平均每株苗的葉片數(shù)目較多，且OsXa5-O

6、E比OmXa5-OE較早出現(xiàn)衰老的葉片。OsXa5-OE和OmXa5-OE的分蘗數(shù)目少于野生型石狩白毛，OsXa5-OE的莖干長度、初生根和次生根的長度均明顯小于野生型石狩白毛和OmXa5-OE。通過對(duì)水稻植株的結(jié)實(shí)率和千粒重的測定，對(duì)照組野生型石狩白毛的結(jié)實(shí)率顯著高于轉(zhuǎn)基因水稻植株OsXa5-OE和OmXa5-OE，且OsXa5-OE的結(jié)實(shí)率顯著高于OmXa5-OE，但三者的千粒重差異不顯著。超表達(dá)OsXa5基因能夠?qū)е滤局仓甑陌?/p>

7、，推測可能是由于轉(zhuǎn)基因水稻植株體內(nèi)的矮桿主效基因作用的結(jié)果，也可能是受到赤霉素和油菜素類固醇等植物生長調(diào)劑的影響。超表達(dá)OmXa5基因使水稻植株種子的結(jié)實(shí)率顯著下降，推測可能是由于OmXa5基因來源于疣粒野生稻，一定程度上保留了疣粒野生稻的性狀，具體原因尚未明確。未發(fā)現(xiàn)超表達(dá)OsXa5和OmXa5基因?qū)λ局仓甑恼ＩL發(fā)育有明顯的影響。
　　為研究超表達(dá)OsXa5和OmXa5基因的植株對(duì)病原菌抗性的影響，在植株的最大分蘗期通過剪

8、葉法接種病原菌黃單胞水稻變種菲律賓生理小種PXO99，PXO280和PXO341。對(duì)病斑的延伸情況進(jìn)行觀察并在接菌21 d后測量并統(tǒng)計(jì)病斑長度。通過對(duì)病斑長度的測量發(fā)現(xiàn)病原菌黃單胞水稻變種菲律賓菌株P(guān)XO99，PXO280和PXO341對(duì)OsXa5-OE和OmXa5-OE均存在致病性，且三個(gè)小種間的致病性存在差異，以菲律賓菌株P(guān)XO99的致病性最強(qiáng)，PXO341的致病性最弱。與對(duì)照組野生型石狩白毛相比超表達(dá)OsXa5在一定程度上改變了植

9、物體對(duì)病原菌黃單胞水稻變種的抗性，而超表達(dá)OmXa5能夠提升植株對(duì)病原菌黃單胞水稻變種的抗性，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。利用基因芯片技術(shù)篩選到OsXa5-OE中與野生型石狩白毛相比的有188個(gè)差異表達(dá)基因并通過定量PCR的驗(yàn)證。在篩選獲得的差異表達(dá)基因中，有139個(gè)基因呈上調(diào)表達(dá)的趨勢，49個(gè)基因呈下調(diào)表達(dá)的趨勢，其中包含WRKY家族基因，細(xì)胞色素P450家族基因，與泛素相關(guān)的基因，與乙烯信號(hào)途徑相關(guān)的基因和過氧化物酶類的基因等。說明OsXa

10、5基因在植物體的防御反應(yīng)信號(hào)途徑中是一個(gè)重要的效應(yīng)因子。參與了植物體中的多種信號(hào)途徑。
　　3.OsXa5和OmXa5互作因子的篩選驗(yàn)證
　　為進(jìn)一步了解OsXa5和OmXa5的互作因子，構(gòu)建了水稻酵母雙雜交cDNA文庫，并對(duì)文庫質(zhì)量進(jìn)行了檢測，符合篩庫的標(biāo)準(zhǔn)。分別以O(shè)sXa5和OmXa5作為酵母雙雜交誘餌蛋白，自激活實(shí)驗(yàn)表明，OsXa5和OmXa5對(duì)酵母菌株MaV203的生長沒有毒性，3AT的濃度均為25 mM。通過共轉(zhuǎn)法

11、從水稻cDNA文庫中篩選互作的因子，初步篩選獲得了73個(gè)與OsXa5存在潛在互作的陽性克隆，59個(gè)與OmXa5存在潛在互作的陽性克隆。通過序列的比對(duì)分析以及雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)的驗(yàn)證。共篩選獲得了4個(gè)與OsXa5互作的因子，分別是類似的組蛋白H2A.2.1(Os05g0461400)，類似泛素(Os09g0420800)，類似的光系統(tǒng)Ⅱ放氧復(fù)合蛋白1(Os01g0501800)和過氧化氫酶同工酶(Os02g0115700)。3個(gè)與OmXa

12、5互作的因子，分別是類似光系統(tǒng)Ⅱ10 kDa多肽(Os07g0147500)、類似捕光復(fù)合物Ⅰ(Os06g0320500)和類似谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶Cla47(Os10g0530500)。從體內(nèi)互作層面上證實(shí)OsXa5參與了植物體內(nèi)的多種抗逆信號(hào)途徑。OmXa5與光合作用途徑中的一個(gè)類似效應(yīng)因子互作，表明OmXa5可能與光合作用介導(dǎo)的信號(hào)途徑相關(guān)，同時(shí)參與谷胱甘肽過氧化物酶防御ROS的過程，介導(dǎo)了植物體抗病反應(yīng)的發(fā)生。
　　4.O

13、sXa5和OmXa5的原核表達(dá)及GST Pull-Down
　　由于酵母雙雜交技術(shù)和雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)均是在生物體內(nèi)驗(yàn)證因子間的相互作用關(guān)系，而在體外是否互作還尚未知曉，因而通過構(gòu)建OsXa5和OmXa5帶有GST標(biāo)簽的融合蛋白，利用L-Arabinose和IPTG在低溫條件下誘導(dǎo)融合蛋白在上清中的表達(dá)，并粗提水稻野生型石狩白毛的愈傷總蛋白，進(jìn)行GST Pull-Down實(shí)驗(yàn)，通過SDS-PAGE的檢測找出差異條帶，割膠回收后進(jìn)行