柑橘對(duì)膠孢炭疽菌的抗性研究.pdf

1、炭疽菌屬(Colletotrichum Corda)真菌是一類全球性分布的植物病原菌，特別是在高溫多濕的熱帶和亞熱帶，可引起果樹、農(nóng)作物等多種植物的炭疽病發(fā)生，造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。其中，由膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）侵染引起的柑橘炭疽病是柑橘的主要真菌病害，幾乎遍布于世界各大柑橘產(chǎn)區(qū)，如美國(guó)、巴西、日本、中國(guó)等。在中國(guó)，柑橘炭疽病也是柑橘產(chǎn)區(qū)發(fā)生最普遍、危害最嚴(yán)重的病害之一，如上海崇明，江西

2、南豐，廣東德慶及云南馬關(guān)等。柑橘炭疽病發(fā)生嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致橘園大面積枝梢干枯、失收甚至全樹果實(shí)落光。
　　目前，柑橘炭疽病以化學(xué)防治為主。殺菌劑的連續(xù)使用，會(huì)導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性從而降低化學(xué)防治效果。同時(shí)，也容易造成果實(shí)農(nóng)藥殘留，對(duì)人類健康和環(huán)境安全構(gòu)成潛在威脅。抗病品種的利用是防治植物病害有效、經(jīng)濟(jì)、安全的措施，而抗性評(píng)價(jià)是抗病育種的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。到目前為止，國(guó)內(nèi)關(guān)于柑橘種質(zhì)資源對(duì)炭疽病的抗性評(píng)價(jià)研究報(bào)道較少。因此，篩選抗炭疽病的柑橘種

3、質(zhì)資源，定位相關(guān)抗性基因，成為柑橘抗炭疽病育種的當(dāng)務(wù)之急。
　　本研究對(duì)課題組保存的16株柑橘炭疽病菌進(jìn)行了菌種鑒定及群體遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)了強(qiáng)致病力膠孢炭疽菌菌株。為研究不同柑橘種質(zhì)對(duì)炭疽病的抗性，本試驗(yàn)采用離體果實(shí)室內(nèi)人工接種法，根據(jù)病情指數(shù)法、病斑平均直徑法和系統(tǒng)聚類分析法等3種不同抗性評(píng)價(jià)方法探討了52份柑橘屬種質(zhì)對(duì)膠孢炭疽菌的抗性。另外，以創(chuàng)建的柑橘分子標(biāo)記遺傳圖譜為基礎(chǔ)，利用“梨橙2號(hào)×晚蜜2號(hào)”及其雜交所得到的F1

4、代68株LW品系的葉片為材料，以嚴(yán)重度和發(fā)病率為依據(jù)，通過(guò)QTL找到抗性相關(guān)的標(biāo)記位點(diǎn)。最后，采用RT-PCR對(duì)部分抗性標(biāo)記位點(diǎn)的相關(guān)基因進(jìn)行驗(yàn)證分析。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)通過(guò)菌落、菌絲、分生孢子、附著胞等形態(tài)學(xué)鑒定，致病性測(cè)定，菌絲融合群鑒定等研究發(fā)現(xiàn)15株菌鑒定為膠孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides），1株菌為尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）。且分離自重慶

5、北碚臍橙的病原菌CQBB-QC與分離自陜西漢中溫州蜜柑的病原菌SXHZ-WZMG-2屬于同一菌絲融合群，與膠孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）相似，為柑橘炭疽病致病菌且是強(qiáng)致病力菌株。ITS基因和TUB2基因序列可以揭示膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）種間的遺傳變異，但不能有效的揭示膠孢炭疽菌（Co

6、lletotrichum gloeosporioides）種內(nèi)的遺傳分化。而GADPH、GS、CHS及CAL基因序列能有效地揭示出膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）種及種下的變異。用ERIC和BOX引物對(duì)柑橘炭疽菌進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)柑橘炭疽菌存在豐富的多樣性，而引物ERIC優(yōu)于引物BOX,遺傳距離為8時(shí)，菌株CQBB-QC和SXHZ-WZMG-2聚為一枝，遺傳距離較近。
　　(2)采用離

7、體果實(shí)室內(nèi)人工接種法，根據(jù)病情指數(shù)法、病斑平均直徑法和系統(tǒng)聚類分析法等3種不同評(píng)價(jià)方法探討了52份不同柑橘屬種質(zhì)對(duì)膠孢炭疽菌的抗性。結(jié)果表明，供試的柑橘屬種質(zhì)可劃分為高抗、抗、中抗和感4類，未發(fā)現(xiàn)免疫和高感種質(zhì)。胡柚、伏令夏橙、火焰葡萄柚、冰糖橙、劉金剛甜橙、哈姆林甜橙、新會(huì)甜橙和晚棱臍橙為高抗種質(zhì)。其它種質(zhì)在不同評(píng)價(jià)方法中均表現(xiàn)出不同程度的抗性。與此同時(shí)，通過(guò)3種柑橘炭疽菌抗性評(píng)價(jià)方法對(duì)“晚蜜2號(hào)×梨橙2號(hào)”及其雜交WL品系部分后代的

8、抗性進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其后代的抗性差異較大。
　　(3)選用“梨橙2號(hào)×晚蜜2號(hào)”及其衍生的68株F1代LW雜交系葉片為材料，采用離體葉片室內(nèi)人工接種法，依據(jù)葉片發(fā)病率和嚴(yán)重度進(jìn)行柑橘炭疽菌的識(shí)別抗性與防御抗性表型分析，隨后進(jìn)行了柑橘抗炭疽病的QTL定位。以構(gòu)建的含有334個(gè)SSR標(biāo)記，9個(gè)連鎖群，總長(zhǎng)844.2 cM，平均圖距2.53 cM的分子遺傳圖譜為基礎(chǔ)，運(yùn)用Map QTL6.0分析軟件，采用區(qū)間作圖法(IM)和多重區(qū)間作圖法

9、(MQM)進(jìn)行QTL相關(guān)位點(diǎn)檢測(cè)優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在LOD≧2.5的情況下，在LW1、LW2、LW3、LW4、LW8、LW9等6個(gè)連鎖群上共檢測(cè)到10個(gè)與柑橘炭疽菌抗性相關(guān)的QTL標(biāo)記位點(diǎn)cSSR250、cBMM88、LcSSR150、LcSSR135、cSSR340、cSSR36、cSSR197、ccSM146-110、cSSR230及F21，且單個(gè)QTL貢獻(xiàn)率范圍在10.3％-35％之間。
　　(4)參照68株F1代LW雜交品系

10、柑橘品種對(duì)炭疽菌的抗性等級(jí)劃分，分別選取高感、感病、中抗、抗病及高抗等12個(gè)品種接種菌株Colletotrichumgloeosporioides CQBB-QC進(jìn)行抗性相關(guān)基因的RT-PCR分析，LW品系葉片接菌處理10 d和1d比較，發(fā)現(xiàn)LcSSR150和ccSM146-110對(duì)應(yīng)基因表達(dá)增強(qiáng)。cSSR250對(duì)應(yīng)基因表達(dá)模式在10 d和1d時(shí)一致，在抗病品種LW-30、LW-43，中抗品種L-2、LW-18，感病品種W-2、LW-4