平頭炭疽菌對(duì)大豆抗感品種的致病差異及其MAPK基因CtPMK1的功能研究.pdf

1、大豆(Glycinemax)是重要的經(jīng)濟(jì)作物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位。由平頭炭疽菌[Colletotrichumtruncatum(Schwein.)Andrus&W.D.Moore]侵染引起的大豆炭疽病是世界上大豆產(chǎn)區(qū)的重要病害之一，可造成大豆嚴(yán)重減產(chǎn)。因此，炭疽病的防治是大豆生產(chǎn)上的一個(gè)重要課題。本研究對(duì)田間采集分離到的大豆炭疽病病原菌進(jìn)行分離鑒定，并從大豆品種的抗性篩選、大豆與炭疽菌的互作、炭疽菌的生長(zhǎng)發(fā)育及致病分子調(diào)控機(jī)制等方

2、面進(jìn)行研究，為認(rèn)識(shí)和掌握該病害發(fā)生以及制定有效的防治策略提供生產(chǎn)上和理論上的依據(jù)。
　　1、從江蘇泰興和江浦兩個(gè)農(nóng)場(chǎng)的大豆田中采集疑似炭疽病標(biāo)本，經(jīng)分離、純化及致病性測(cè)定得到41株致病菌。發(fā)現(xiàn)這些病原菌主要存在兩種菌落生長(zhǎng)形態(tài)，其中一種與已報(bào)道的平頭炭疽菌相似，菌落為規(guī)則的圓形，邊緣整齊，菌絲疏松，幼嫩菌絲為白色，老齡菌絲為灰色;另一種未見有報(bào)道，菌落為不規(guī)則的圓形，邊緣不整齊，氣生菌絲少，中部菌絲為白色絨毛狀，外圍菌絲呈鮮艷的紅

3、褐色。從這兩種形態(tài)的致病菌中分別選取一株致病性強(qiáng)的代表性菌株進(jìn)行ITS(internaltranscribedspacer)測(cè)序，測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)與平頭炭疽菌C.truncatum同源性均達(dá)到100％。綜合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法，將這兩類炭疽菌均鑒定為平頭炭疽菌，用于后續(xù)研究。
　　2、選育和利用抗病品種是防治大豆炭疽病的一種經(jīng)濟(jì)有效的方法。明確大豆種質(zhì)對(duì)大豆炭疽病的抗性，是大豆抗病育種的前提條件。本研究采用孢子懸浮液接種離體葉片的方

4、法，選用前面鑒定的兩類平頭炭疽菌代表性菌株JS11-32和TB8-15，對(duì)59份浙江大豆品種進(jìn)行抗大豆炭疽病鑒定篩選研究，發(fā)現(xiàn):對(duì)菌株JS11-32表現(xiàn)抗性的大豆品種占96.61％，對(duì)TB8-15表現(xiàn)抗性的品種占55.93％，而且對(duì)TB8-15表現(xiàn)抗性的品種對(duì)JS11-32均表現(xiàn)抗性。可見浙江大豆種質(zhì)資源對(duì)平頭炭疽菌抗性較好，可以嘗試將部分抗性品種推廣。
　　3、通過臺(tái)盼藍(lán)染色對(duì)表現(xiàn)抗性（即非親和互作）的大豆品種5D068與作為對(duì)

5、照的感病品種（即親和互作）合豐47進(jìn)行侵染差異觀察。發(fā)現(xiàn):在接種炭疽菌后24h內(nèi)，兩個(gè)品種中均出現(xiàn)分生孢子萌發(fā)和附著胞的形成;接種48h后，病原菌在感病品種葉片內(nèi)形成侵染菌絲，而抗病品種葉片則顯示類似HR(HypersensitiveReaction)的細(xì)胞壞死反應(yīng)。經(jīng)DAB染色我們發(fā)現(xiàn)在侵染早期，抗病葉片在附著胞下面以及受侵染細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，甚至周圍未侵染細(xì)胞邊界也有ROS;而感病葉片只在附著胞的周圍有少量ROS的產(chǎn)

6、生。
　　4、MAPK信號(hào)通路在真核生物中相當(dāng)保守，在病原真菌感受外界刺激、生長(zhǎng)發(fā)育與形態(tài)建成、孢子產(chǎn)生與萌發(fā)等過程中具有非常重要的作用。本研究中，參照已公布全基因組序列的膠孢炭疽C.gloeosporioides和希金斯炭疽Chigginsianum中與Fus3-Kss1類MAPK基因同源的基因序列，設(shè)計(jì)引物在平頭炭疽菌Ctruncatum中克隆到一個(gè)同源基因，命名為CtPMK1。該基因編碼一個(gè)含355個(gè)氨基酸的多肽，含有MAP

7、K共有的11個(gè)蛋白激酶區(qū)域和1個(gè)MAPK激酶作用的磷酸化位點(diǎn)(TEY)。該基因敲除導(dǎo)致突變體菌絲生長(zhǎng)速率下降、黑色素生成減少以及產(chǎn)孢量顯著下降;突變體喪失對(duì)大豆葉片的侵染能力，進(jìn)一步試驗(yàn)觀察到突變體分生孢子在洋蔥表皮細(xì)胞上無法形成附著胞，突變體菌絲頂端也無法形成附著胞類似結(jié)構(gòu)。上述結(jié)果表明，CtPMK1參與調(diào)控炭疽病菌的侵入，從而影響炭疽菌對(duì)大豆的致病性。將Magnaportheoryzae中的PMK1基因互補(bǔ)CtPMK1缺失突變體，表