NFκB1和IκBα基因遺傳變異與慢性阻塞性肺疾病和肺癌易感性研究.pdf

1、研究背景：
　　慢性阻塞性肺疾?。–hronicobstructivepulmonarydisease，COPD）和肺癌（Lungcancer，LC）是呼吸系統(tǒng)常見(jiàn)的兩種疾病。最新數(shù)據(jù)顯示我國(guó)40歲以上人群COPD的患病率已達(dá)8.2％，在我國(guó)部分地區(qū)已位居居民死因第四位。肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均居于癌癥首位。最新的世界衛(wèi)生組織報(bào)告顯示我國(guó)肺癌男女發(fā)病率均位于世界前列，且女性發(fā)病率（21.3/10萬(wàn)）明顯高于歐美等

2、發(fā)達(dá)國(guó)家。近幾十年來(lái)，隨著我國(guó)工業(yè)化、城市化進(jìn)程加快所帶來(lái)的各種環(huán)境污染問(wèn)題的加劇，COPD與肺癌的發(fā)病率與死亡率也急劇上升，已成為當(dāng)前威脅我國(guó)居民生存健康的主要疾病之一。
　　COPD與肺癌關(guān)系密切，既往大量流行病學(xué)研究表明兩者具有共同的環(huán)境暴露，如吸煙、大氣污染、生物燃料使用、肺部感染等。其中，吸煙是兩者最主要的共同環(huán)境病因，研究表明60%以上COPD和90%肺癌的發(fā)病都與吸煙相關(guān)，但僅有20-30%的吸煙者會(huì)患COPD，10

3、-15%的吸煙者會(huì)患肺癌，提示個(gè)體易感因素在兩者的發(fā)病過(guò)程中起著決定性的作用。近年來(lái)，遺傳易感因素與COPD和肺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)被廣泛報(bào)道，多個(gè)人群關(guān)聯(lián)研究尤其是全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）報(bào)道了多個(gè)疾病易感位點(diǎn)。我們通過(guò)比對(duì)肺癌、肺功能和COPD的全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS），發(fā)現(xiàn)兩者的易感基因在人染色體上定位基本是重疊的。COPD與肺癌的病因譜和易感基因的存在廣泛重疊，表明COPD與肺癌可能存在共同的發(fā)病機(jī)制。
　　炎癥反應(yīng)被

4、認(rèn)為是COPD和肺癌的共同發(fā)病機(jī)制。煙草等環(huán)境毒物能夠刺激肺部的炎癥反應(yīng)，引起炎癥相關(guān)分子如核轉(zhuǎn)錄因子-kappaB(NucleartranscriptionfactorkappaB，NFκB)等的異常激活，導(dǎo)致免疫反應(yīng)異常等一系列機(jī)體反應(yīng)，最終促進(jìn)COPD或肺癌的發(fā)病。同時(shí)，COPD還可使肺部長(zhǎng)期處于炎癥狀態(tài)和誘發(fā)肺基質(zhì)重構(gòu)，促進(jìn)肺部癌前病變的發(fā)生，增加肺癌的發(fā)病危險(xiǎn)。NFκB是機(jī)體細(xì)胞內(nèi)調(diào)控炎癥反應(yīng)的核心分子，其內(nèi)源性抑制物-核轉(zhuǎn)錄

5、因子kappaB抑制蛋白（InhibitorofnucleartranscriptionfactorkappaB，NFKBI，又稱(chēng)IκB）可抑制其活性，NFκB與IκB的平衡是機(jī)體調(diào)控炎癥最有效的手段。研究發(fā)現(xiàn)COPD和肺癌的發(fā)病過(guò)程中皆存在NFκB異?；罨透弑磉_(dá)現(xiàn)象，且在重度吸煙者，COPD患者和肺癌患者中NFκB的表達(dá)水平同樣明顯高于正常人。提示NFκB的異?；罨赡苁荂OPD和肺癌發(fā)病的共同機(jī)制。
　　NFκB家族有五個(gè)成

6、員，包括：p105/p50，p52/p100，p65/RelA，c-Rel和RelB。在哺乳動(dòng)物中，p105/p50和p52/p100這兩種蛋白分別由NFκB1和NFκB2基因編碼，最主要的二聚體是p50和p65/RelA亞單位。在靜息細(xì)胞中，NFκB可被其抑制蛋白（IκB蛋白家族）隔絕而失活，在IκB蛋白家族中最普遍存在的是IκBα。前期關(guān)聯(lián)研究報(bào)道了多個(gè)位于NFκB1、NFκB2和IκBα基因的單核苷酸多態(tài)性(SingleNucle

7、otidePolymorphism，SNP)[例如NFκB1基因(-94del>insATTG)，IκBα基因(-826C>T，2758G>A)等]可影響其基因的功能，從而與多種疾病發(fā)病相關(guān)，包括炎癥性疾?。ㄈ鐗乃佬孕∧c結(jié)腸炎、酒精性肝硬化等）、自身免疫性疾病（如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化病、白塞氏病等）和惡性腫瘤（如肝癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌等）。NFκB/IκB與COPD和肺癌發(fā)病密切相關(guān)，上述遺傳變異極有可能改變基因的功能，影響肺部

8、的炎癥狀態(tài)，從而影響COPD和肺癌的發(fā)生發(fā)展，因此，本課題擬通過(guò)廣州和蘇州兩個(gè)人群的研究探討NFκB/IκB基因的遺傳變異與COPD和肺癌發(fā)病的關(guān)聯(lián)，并通過(guò)功能實(shí)驗(yàn)闡述其影響疾病發(fā)生的分子機(jī)制。
　　科學(xué)假說(shuō)：
　　環(huán)境因素可通過(guò)激活NFκB信號(hào)通路，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)和腫瘤發(fā)生。NFκB1、NFκB2和IκBα是人類(lèi)NFκB信號(hào)通路最常見(jiàn)的核心分子，前期研究已報(bào)道NFκB1、NFκB2和IκBα基因上的功能性多態(tài)與

9、多個(gè)疾病發(fā)病相關(guān)，因此我們提出NFκB1、NFκB2和IκBα三個(gè)基因的遺傳變異可能會(huì)改變其基因功能，從而影響人群COPD和肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)性的研究假說(shuō)。
　　研究目的：
　　探討NFκB/IκB基因4個(gè)潛在功能性SNP[NFκB1基因(-94del>insATTG)，NFκB2基因(-2966G>A)和IκBα基因(-826C>T，2758G>A)]與COPD和肺癌發(fā)病的關(guān)聯(lián)；分析基因-基因以及基因-環(huán)境交互作用對(duì)COPD和肺

10、癌發(fā)病中的影響，揭示上述遺傳變異的生物學(xué)實(shí)質(zhì)，以探索COPD和肺癌的共同易感機(jī)制，為COPD和肺癌的預(yù)防、診斷、治療提供科學(xué)依據(jù)。
　　研究方法：
　　本研究采用雙中心病例-對(duì)照研究，在廣州和蘇州這兩個(gè)地區(qū)開(kāi)展，分別在廣州人群和蘇州人群中收集病例和對(duì)照。其中，廣州人群中收集的研究對(duì)象包括1025例COPD病例，1056例肺癌病例和1061例健康正常對(duì)照；蘇州人群中收集的研究對(duì)象包括486例COPD病例，503肺癌病例和616

11、健康正常對(duì)照。調(diào)查員先經(jīng)培訓(xùn)合格后參與調(diào)查，通過(guò)詢(xún)問(wèn)研究對(duì)象，記錄人口學(xué)基本特征和環(huán)境變量，包括吸煙、飲酒、既往史、家族史、職業(yè)史等。調(diào)查后填寫(xiě)調(diào)查表，并在調(diào)查表上簽名。經(jīng)簽署知情同意書(shū)后，病例和對(duì)照皆采集外周靜脈血5ml，并提取DNA進(jìn)行后續(xù)分子流行病學(xué)檢測(cè)。另外，2002年至2010年期間在廣州地區(qū)3個(gè)社區(qū)開(kāi)展了長(zhǎng)期的COPD隨訪(fǎng)，每年對(duì)這些研究對(duì)象進(jìn)行肺功能檢測(cè)，已收集116例COPD患者和357例健康人的肺功能4年隨訪(fǎng)資料。

12、r>　　在以往的研究中，對(duì)NFκB1、NFκB2和IκBα基因的遺傳變異與人群疾病發(fā)病的關(guān)聯(lián)進(jìn)行了探討。其中，NFκB1基因-94del>insATTG(rs28362491)，NFκB2基因-2966G>A(rs12769316)，IκBα基因-826C>T(rs2233406)和2758G>A(rs696)四個(gè)位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性被報(bào)道與多個(gè)疾病發(fā)病相關(guān)，并且-94del>insATTG，2758G>A這兩個(gè)位點(diǎn)已被證實(shí)為功能性位點(diǎn)

13、。因此，本研究我們擬從上述4個(gè)遺傳變異位點(diǎn)出發(fā)，分析NFκB1、NFκB2和IκBα基因的遺傳變異與COPD和肺癌易感性的關(guān)聯(lián)，闡述COPD和肺癌的共同發(fā)病機(jī)制。
　　運(yùn)用Taqman法檢測(cè)兩個(gè)地區(qū)的病例和對(duì)照四個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的基因型。由于-94del>insATTG變異的生物學(xué)功能已經(jīng)被證實(shí)，我們重點(diǎn)分析2758G>A多態(tài)性的生物學(xué)功能。采用Real-timePCR方法檢測(cè)肺癌組織和癌旁組織中IκBα的mRNA水平，采用Weste

14、rnblotting方法檢測(cè)肺癌組織和癌旁組織中IκBα的蛋白質(zhì)水平，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)IκBα在肺癌組織中的原位表達(dá)水平。
　　通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，IκBα基因2758G>A變異可能會(huì)影響miR-449a和miR-34b與IκBα基因3’非翻譯區(qū)3’-UTR結(jié)合的能力，所以我們利用體外實(shí)驗(yàn)熒光素酶基因報(bào)告系統(tǒng)，分析在未經(jīng)任何microRNA干擾下IκBα基因的表達(dá)，采用real-timePCR方法檢測(cè)在有效microRN

15、A干擾下，A549(2758GG基因型)和NCI-520(2758AG基因型)細(xì)胞系中IκBα基因的表達(dá)。
　　運(yùn)用卡方檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)分析病例組和對(duì)照組在性別、年齡、吸煙、飲酒、既往史等人口學(xué)特征的差異。運(yùn)用單因素非條件logistic回歸模型，分析每個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與疾病發(fā)生的危險(xiǎn)性關(guān)聯(lián)，采用相乘交互作用模型分析環(huán)境-基因交互作用的可能性。在分層分析中，采用Breslow-Day檢驗(yàn)各層樣本的同質(zhì)性。利用PS軟件計(jì)算統(tǒng)計(jì)效能。

16、分別運(yùn)用單因素方差分析、Student’st檢驗(yàn)和線(xiàn)性回歸模型，分析不同NFκB1基因型人群的肺功能值、每年的第一秒用力呼氣容積（Forcedexpiratoryvolumein1second，F(xiàn)EV1）下降值的差異，不同IκBα基因型的IκBαmRNA水平和蛋白表達(dá)的差異。采用Student’st檢驗(yàn)分析含不同等位基因的質(zhì)粒中的luciferase報(bào)告基因表達(dá)水平的差異。應(yīng)用SAS9.13軟件進(jìn)行分析，所有的檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)

17、為α=0.05，P<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　在對(duì)照組中，NFκB1基因-94del>insATTG(rs28362491)；NFκB2基因-2966G>A(rs12769316)；IκBα基因-826C>T(rs2233406)和IκBα基因2758G>A(rs696)四個(gè)位點(diǎn)基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡，說(shuō)明對(duì)照組符合隨機(jī)人群分布的標(biāo)準(zhǔn)。
　　在廣州人群中，多態(tài)性位點(diǎn)-9

18、4del>insATTG與COPD發(fā)病有關(guān)聯(lián)(P<0.05)，多態(tài)性位點(diǎn)2758G>A與肺癌發(fā)病有關(guān)聯(lián)(P<0.05)。以攜帶del/del基因型的個(gè)體為參照，-94ins變異基因型(ins/ins+ins/del)的攜帶者發(fā)生COPD的危險(xiǎn)性是del/del基因型攜帶者的1.23倍(OR=1.23；95%CI=1.03-1.54；P=0.037)。但在肺癌組中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象。與2758GA+GG基因型攜帶者相比，2758AA基因型攜

19、帶者罹患肺癌的危險(xiǎn)性是2758GA+GG基因型攜帶者的1.61倍(OR=1.61；95%CI=1.31-1.96；P=0.000)。此外，我們既未發(fā)現(xiàn)-2966G>A和-826C>T這兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與COPD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)，也未發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)。
　　在蘇州人群中，我們進(jìn)一步驗(yàn)證了上述陽(yáng)性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，得出的結(jié)果與廣州人群中的結(jié)果一致。在蘇州人群中，多態(tài)性位點(diǎn)-94del>insATTG與COPD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)聯(lián)

20、(P<0.05)，多態(tài)性位點(diǎn)2758G>A和肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)聯(lián)(P<0.05)。以攜帶del/del基因型者為參照，攜帶-94ins變異基因型(ins/ins+ins/del)者COPD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是攜帶del/del基因型者的1.33倍(OR=1.33；95%CI=1.04-1.81；P=0.047)，而-94ins基因型與肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)聯(lián)(OR=1.13；95%CI=0.84-1.53；P=0.417)。以攜帶2758GG/AG基因型

21、者為參照，2758AA基因型攜帶者罹患肺癌的危險(xiǎn)性是2758GG/AG基因型攜帶者的1.69倍(OR=1.69；95%CI=1.27-2.25；P=0.003)，但未發(fā)現(xiàn)其與COPD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)聯(lián)。
　　經(jīng)同質(zhì)性檢驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)廣州人群和蘇州人群研究結(jié)果具有同質(zhì)性(Breslow-Daytest，NFκB1基因-94del>insATTG：P=0.734；IκBα基因2758G>A：P=0.941)，我們合并了廣州人群和蘇州人群數(shù)

22、據(jù)以提高統(tǒng)計(jì)效能，結(jié)果顯示攜帶-94ins變異基因型(ins/ins+ins/del)的個(gè)體罹患COPD危險(xiǎn)性是攜帶del/del基因型個(gè)體的1.27倍(OR=1.27；95%CI=1.06-1.52；P=0.009)。而攜帶2758AA基因型個(gè)體患肺癌風(fēng)險(xiǎn)是攜帶其他基因型個(gè)體的1.63倍(OR=1.63，95%CI=1.39-1.92；P=0.000)。
　　COPD是肺癌發(fā)病的危險(xiǎn)因素，攜帶危險(xiǎn)基因型的COPD病例發(fā)生肺癌的危

23、險(xiǎn)性可能會(huì)更高。因此，我們進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)在前期罹患COPD且攜帶2758AA或-94ins危險(xiǎn)基因型的人發(fā)生肺癌的風(fēng)險(xiǎn)皆顯著增加(2758AA：OR=1.68，95%CI=1.23-2.28; P=0.001;-94insATTG：OR=1.50，95%CI=1.01-2.21;P=0.043但在前期未催患COPD的患者中，-94ins變異基因型對(duì)肺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)性影響不明顯。聯(lián)合這兩個(gè)基因型分析發(fā)現(xiàn)，以前期未催患COPD的個(gè)體為參照，攜

24、帶一個(gè)或兩個(gè)危險(xiǎn)基因型的前期催患COPD的患者催患肺癌的危險(xiǎn)性更高，OR值更高，特別是在攜帶兩種危險(xiǎn)基因型的COPD患者中，肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)更高(OR=2.52,95%CI=1.52-4.18;P=0.000)。
　　我們分析NFκB1基因型對(duì)肺功能的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)攜帶-94ins ATTG變異基因型的COPD患者，使用支氣管擴(kuò)張劑前的FEV1值明顯低于攜帶-94de1/del ATTG基因型的COPD患者(方差分析P=0.004;t檢

25、驗(yàn)P=0.002)。在對(duì)照組中，與攜帶其他基因型者相比，攜帶-94ins ATTG基因型者的吸入支氣管擴(kuò)張劑后的FEV1占預(yù)計(jì)值百分比較低(t檢驗(yàn)P=0.021)。但是，無(wú)論是COPD病例組，還是對(duì)照組，均未發(fā)現(xiàn)IκBα基因的兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)基因型與肺功能值之間的關(guān)聯(lián)。
　　通過(guò)線(xiàn)性回歸分析發(fā)現(xiàn)，-94ins/del ATTG多態(tài)性位點(diǎn)基因型與吸入支氣管擴(kuò)張劑前的FEV1值每年下降趨勢(shì)有關(guān)(-94ins/ins ATTG：n= 62

26、，-0.126±0.113L，-94ins/delATTG：n= 42，-0.091±0.083L，-94de1/del ATTG：n=12，-0.040±0.036L，方差分析P=0.015，線(xiàn)性回歸分析P=0.017)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，-94de1>ins ATTG多態(tài)性與COPD病情進(jìn)展有關(guān)聯(lián)，與COPD嚴(yán)重程度Gold分級(jí)有關(guān)聯(lián)(p=0.048)。但未發(fā)現(xiàn)IκBα基因單核苷酸多態(tài)性與肺功能值變化之間的關(guān)聯(lián)。
　　我們發(fā)現(xiàn)，

27、肺癌組織IκBα基因的mRNA表達(dá)水平明顯低于癌旁組織(t檢驗(yàn)P=0.032)，提示IκBα可能起到抑制腫瘤的作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，攜帶2758AA基因型的患者IκBα的mRNA水平在肺癌組織(方差分析P=0.001，線(xiàn)性回歸分析P=0.008)和癌旁組織(方差分析P=0.002，線(xiàn)性回歸分析P=0.004)中攜帶2758GG或AG基因型的患者。IκBα蛋白表達(dá)檢測(cè)進(jìn)一步確證了上述結(jié)果。另外，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，攜帶2758AA基因

28、型患者肺癌組織中原位IκBα的表達(dá)明顯低于攜帶2758GG或AG基因型患者(方差分析P=0.045)。
　　運(yùn)用熒光素酶(Luciferase)報(bào)告基因分析法檢測(cè)含IκBα基因3'-UTR中2758A或2758G質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性，發(fā)現(xiàn)含2758A報(bào)告基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄活性明顯低于含2758G的報(bào)告基因((P值分別是0.022，0.036);加入miR-449a模擬物能夠進(jìn)一步減少含2758A報(bào)告基因的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性(P=0.046，P

29、< 0.001)，而加入miR-449a抑制劑能夠上調(diào)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性(P=0.003 P < 0.001)。然而，miR-34b模擬物對(duì)含2758A或2758G的報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄活性均沒(méi)有明顯影響，提示2758A可能是miR-449a結(jié)合位點(diǎn)。
　　創(chuàng)新之處：
　　本研究發(fā)現(xiàn)，NFκB1啟動(dòng)子區(qū)-94de1>ins ATTG變異可引起機(jī)體肺功能下降速度加快，增加COPD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn);IκBα基因3'-UTR的2758G>A變異