馬鞭草提取液對(duì)體外培養(yǎng)人早孕蛻膜細(xì)胞的影響.pdf

1、計(jì)劃生育是中國(guó)的一項(xiàng)基本國(guó)策,抗生育藥物的研制則是計(jì)劃生育工作的重要組成部分.目前臨床抗生育藥物主要是甾體合成藥,作用位點(diǎn)高且多系抗排卵藥物,對(duì)機(jī)體內(nèi)分泌有一定的干擾.而中草藥則具有特有的天然療效,作用位點(diǎn)低,副作用小等特點(diǎn);對(duì)馬鞭草有效部位進(jìn)行提取分離,篩選出其抗生育的有效組分或有效成分,對(duì)于開(kāi)發(fā)新型計(jì)劃生育藥物具有非常重要的意義.蛻膜是孕卵著床和胚胎發(fā)育所必須的組織,用藥物干擾蛻膜的發(fā)育應(yīng)是理想的抗早孕手段.體外細(xì)胞培養(yǎng)以其直觀、便

2、利展現(xiàn)了其獨(dú)特的優(yōu)越性.馬鞭草有破血通經(jīng)、利尿消腫等作用,孕婦忌用.該院曾對(duì)76例停經(jīng)33-42天健康早孕婦女口服馬鞭草粉劑,流產(chǎn)成功率達(dá)83.4﹪.孕早期人絨毛組織體外培養(yǎng)顯示,馬鞭草能明顯抑制絨毛生長(zhǎng)及滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌HCG的功能;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,馬鞭草也能明顯抑制胚胎生長(zhǎng)而使其固縮死亡,破壞滋養(yǎng)層細(xì)胞,對(duì)小鼠有明顯的抗早孕作用.但對(duì)馬鞭草是否能抑制蛻膜細(xì)胞的生長(zhǎng)還不甚清楚,以及對(duì)于馬鞭草終止早孕的有效部位的確定國(guó)內(nèi)也尚未有報(bào)道.中藥抗

3、生育效果良好,副作用小;服用方便,已成為各國(guó)當(dāng)前日益關(guān)注的課題.目前,應(yīng)用中草藥抗孕方面的研究雖然有些報(bào)道,但缺乏基礎(chǔ)細(xì)胞等方面深入的研究.該研究目的首先是進(jìn)行蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng),并對(duì)其培養(yǎng)方法做了一定的改進(jìn),然后觀察經(jīng)不同提取途徑獲得的馬鞭草提取液A、B、C、D及米非司酮對(duì)蛻膜細(xì)胞形態(tài),增殖,細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)的影響.從而了解馬鞭草抗生育的機(jī)制及有效抗生育作用組分及作用位點(diǎn).第一部分人類蛻膜基質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)的研究目的:建立良

4、好的人類蛻膜機(jī)質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)方法.方法:實(shí)驗(yàn)選用早孕人工流產(chǎn)蛻膜組織進(jìn)行體外培養(yǎng),配制FD完全培養(yǎng)液及0.25﹪胰蛋白酶和0.02﹪EDTA(1:1)消化液,進(jìn)行全組分蛻膜細(xì)胞培養(yǎng),24小時(shí)后換液,清除未貼壁的蛻膜細(xì)胞及紅細(xì)胞.視細(xì)胞生長(zhǎng)情況,2~3天換培養(yǎng)液一次.待細(xì)胞融合達(dá)80﹪時(shí),用0.25﹪胰蛋白酶與0.02EDTA(1:1)消化貼壁細(xì)胞,傳代.利用傳三代的方法對(duì)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行分離提純.傳三代時(shí)部分細(xì)胞用蓋片法培養(yǎng),制作細(xì)胞爬片,

5、用泌乳素(prolactin PRL)免疫組化試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞成分,鑒定細(xì)胞純度.結(jié)論:該實(shí)驗(yàn)方法經(jīng)濟(jì)實(shí)用、簡(jiǎn)單,簡(jiǎn)化了蛻膜細(xì)胞的提純程序,獲得的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞純度高.第二部分馬鞭草提取液及米非司酮對(duì)體外培養(yǎng)人早孕蛻膜細(xì)胞的的影響目的:1.探討馬鞭草及米非司酮抗早孕的細(xì)胞學(xué)作用機(jī)理;2.初步確定馬鞭草抗生育的有效部位.方法:1.取正常妊娠6-9周婦女人工流產(chǎn)的蛻膜組織,進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng),傳三代后接種于培養(yǎng)瓶中.培養(yǎng)24小時(shí)后,換液,分為

6、含25mg/ml(含馬鞭草生藥)的A、B、C、D組(A、B、C、D分別為馬鞭草石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇提取液,每毫升含生藥1克)及80 ug/ml的米非司酮組及未加藥組.繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí),在倒置顯微鏡下觀察.2.將傳三代后的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞接種與三塊96孔培養(yǎng)板,設(shè)三復(fù)孔.24小時(shí)后對(duì)照組加入培養(yǎng)液200ul,加藥組分別加含A、B、C、D及米非司酮培養(yǎng)液2 00ul,A、B、C、D的終濃度為1 2.5mg/ml,2 5mg/ml,5 0

7、mg/ml(含馬鞭草生藥).米非司酮的終濃度為80ug/ml.加藥后分別繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí),48小時(shí),72小時(shí).MTT顯色法測(cè)各孔的吸光度OD值.3.培養(yǎng)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞,傳三代后接種于培養(yǎng)瓶中(共30瓶,平分為6組).培養(yǎng)24小時(shí)后,分為加入25mg/ml(含馬鞭草生藥)的A、B、C、D及25mg/ml的米非司酮組及未加藥組.繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后FACScan流式細(xì)胞儀測(cè)定熒光強(qiáng)度.對(duì)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)進(jìn)行分析.結(jié)論:1.馬鞭草的石油醚