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文檔簡介
1、目的:1.優(yōu)化黃精總皂苷的提取工藝及測定經(jīng)過大孔樹脂(D101)洗脫得到的黃精總皂苷的含量。
2.通過建立慢性應(yīng)激抑郁大鼠模型,觀察優(yōu)化提取得到的黃精總皂苷(saponins of rhizoma polygonati,SRP)對(duì)抑郁模型大鼠行為學(xué)和海馬、大腦皮層和下丘腦內(nèi)的神經(jīng)元數(shù)目,及海馬和大腦皮層內(nèi)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF) 及其受體酪氨酸激酶B
2、(tyrosine kinase B,TrkB)表達(dá)的影響,探討SRP抗抑郁可能的作用機(jī)制。
方法:
1.稱取黃精生藥材,在提取時(shí)間為2小時(shí),提取次數(shù)為2次,料液比為1:15的基礎(chǔ)上,設(shè)置多指標(biāo)、多因素L9(34)正交試驗(yàn)。擬定影響提取效果的三個(gè)主要影響因素,即:A(溫度)、B(乙醇濃度)、C(pH)為優(yōu)選因素,每個(gè)因素設(shè)定三個(gè)水平A(40℃、60℃、80℃)、B(70%、75%、80%)、C(8、7、6)。
3、采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),以總皂苷的含量為指標(biāo),優(yōu)化SRP的提取條件。以薯蕷皂苷為對(duì)照品,在546nm處,采用香草醛-高氯酸比色法測定總皂苷的含量。以得到SRP的提取優(yōu)化條件。在優(yōu)化的提取方案的條件下提取的乙醇浸膏苷用蒸餾水、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇過大孔樹脂D101,收集30%乙醇、50%乙醇、75%乙醇洗脫液,減壓濃縮得SRP,測其SRP的含量。
2.采用孤養(yǎng)加長期不可預(yù)見性應(yīng)激(d1~d21
4、)的方法建立慢性應(yīng)激抑郁大鼠模型,以SRP(30,60,120 mg·kg-1,ig,d1~d21)治療給藥,氟西汀(Fluoxetine,F(xiàn)lu)(2mg·kg-1,ig,d1~d21)作為陽性對(duì)照。正常組和模型組給予等體積的羧甲基纖維素鈉溶液。
分別稱取各組大鼠在實(shí)驗(yàn)第1天和第21天的體重,實(shí)驗(yàn)第21天體重減去實(shí)驗(yàn)第1天體重為各組大鼠的體重增長值;通過大鼠自主活動(dòng)程序儀、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)、測定大鼠糖水?dāng)z入量及懸尾
5、不動(dòng)時(shí)間來觀察大鼠行為學(xué)的變化。
采用HE染色來觀察大鼠海馬、大腦皮層和下丘腦內(nèi)的神經(jīng)元數(shù)目的變化;采用免疫組化法測定大鼠海馬和大腦皮層內(nèi)BDNF和及TrkB的表達(dá)。
結(jié)果:
1.提取實(shí)驗(yàn)的結(jié)果
從正交試驗(yàn)的結(jié)果可以看出,各因素對(duì)SRP的提取率影響不同,各處理組合極差順序?yàn)镽B>RA>RC,即影響最大的是溶劑乙醇的濃度,其次是溫度和pH。最優(yōu)提取方案應(yīng)為A2B2C3,即乙醇濃度為7
6、5%,溫度為60℃,pH=6;在優(yōu)化的提取方案的條件下提取并經(jīng)過大孔樹脂洗脫得到的SRP的含量為51.8%。
2.SRP的藥效實(shí)驗(yàn)的結(jié)果
2.1 SRP對(duì)慢性應(yīng)激抑郁大鼠體重的影響
實(shí)驗(yàn)的第1天,各組大鼠體重比較差異無顯著性;實(shí)驗(yàn)的第21天,與正常組大鼠相比,模型組大鼠體重增長值明顯減少;與模型組大鼠相比,SRP(30,60,120 mg·kg-1)組大鼠體重增長值均有增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。<
7、br> 2.2SRP對(duì)慢性應(yīng)激抑郁大鼠行為學(xué)的影響
(1)模型組大鼠自主活動(dòng)次數(shù)明顯少于正常組;與模型組比較,SRP(30,60,120 mg·kg-1)組大鼠自主活動(dòng)次數(shù)均有增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
(2)模型組大鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間長于正常組;與模型組比較,SRP(30,60,120 mg·kg-1)組大鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間均有縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
(3)模型組大鼠糖水?dāng)z入量較正常組明顯減少
8、;與模型組比較,SRP(30,60,120 mg·kg-1)組大鼠的糖水?dāng)z入量均有增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
(4)在定位航行試驗(yàn)的第4天,模型組大鼠的逃避潛伏期明顯長于正常組;與模型組相比,SRP(30,60,120 mg·kg-1)組大鼠的逃避潛伏期均有縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在空間探索試驗(yàn)中,模型組大鼠在原平臺(tái)象限的搜索時(shí)間明顯長于正常組;與模型組相比,SRP(30,60,120 mg·kg-1)組大鼠在原平臺(tái)象限的搜
9、索時(shí)間均有所縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.3 SRP對(duì)慢性應(yīng)激抑郁大鼠海馬、大腦皮層和下丘腦內(nèi)的神經(jīng)元數(shù)目的影響
模型組大鼠海馬和大腦皮層內(nèi)的神經(jīng)元數(shù)目明顯低于正常組大鼠;與模型組相比,SRP(30,60,120 mg·kg-1)組大鼠海馬和大腦皮層內(nèi)的神經(jīng)元數(shù)目均有升高,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
各組下丘腦內(nèi)幾乎無神經(jīng)元細(xì)胞,有較多的淋巴細(xì)胞、星形細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞。
2.4 SRP對(duì)慢
10、性應(yīng)激抑郁大鼠海馬、大腦皮層內(nèi)BDNF和TrkB表達(dá)的影響
與正常組相比,模型組大鼠海馬、大腦皮層內(nèi)BDNF和TrkB免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元數(shù)量減少,平均灰度值較低,差異有顯著性(P<0.05,P<0.01)。Flu組和SRP(30,60,120 mg·kg-1)組大鼠海馬、大腦皮層內(nèi)BDNF免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯增加,平均灰度值明顯增高,與模型組比較差異有顯著性(P<0.05,P<0.01);Flu組大鼠海馬各區(qū)BDNF
11、和TrkB免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元數(shù)量也有明顯的增多,平均灰度值增高,與模型組相比差異有顯著性(P<0.05,P<0.01)。
大腦皮層各斷面均可見到BDNF和TrkB染色陽性細(xì)胞,多見于皮質(zhì)Ⅱ~Ⅵ層,染色反應(yīng)較強(qiáng),細(xì)胞輪廓清晰,陽性顆粒位于胞質(zhì)和突起內(nèi)。以及集中于海馬CA1、CA3區(qū)錐體細(xì)胞和齒狀回顆粒細(xì)胞。
結(jié)論:
1.通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,各因素對(duì)SRP的提取率影響是不均等的,影響最大的
12、是乙醇濃度,其次是溫度和pH。最佳提取工藝為:在提取時(shí)間為2小時(shí),提取次數(shù)為2次,料液比為1:15的基礎(chǔ)上,提取溶劑乙醇的濃度為75%,溫度:60℃,pH=6。
2.SRP可以改善慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠的抑郁樣行為,如自主活動(dòng)次數(shù)減少、糖水?dāng)z入量減少、懸尾不動(dòng)時(shí)間延長及學(xué)習(xí)記憶能力下降等,提示SRP可能具有一定的改善抑郁癥狀的作用。
3.SRP能有效地抑制海馬細(xì)胞表達(dá)BDNF和TrkB的降低,陽性細(xì)胞數(shù)目顯著增
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