淫羊藿苷聯(lián)用三七總皂苷對AD模型鼠學(xué)習(xí)記憶的影響及其作用機制探討.pdf

1、目的: 在前期研究工作中，根據(jù)中藥復(fù)方益智健腦顆粒的組方，從其主要組成藥物中篩選出治療阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的有效成分組合—淫羊藿苷(Icariin，ICA)與三七總皂苷(Panax Notoginseng Saponins，PNS)，本次研究以ICA聯(lián)用PNS對AD模型小鼠—P8系快速老化小鼠(senescence-accelerated pronemice8，SAMP8)進行干預(yù)，檢測干預(yù)后SA

2、MP8的行為學(xué)改變，并應(yīng)用從蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析ICA聯(lián)用PNS治療AD的潛在作用靶點，探討其防治AD的作用機制。
　　方法: 將50只6月齡雄性SAMP8隨機分為低劑量治療組、中劑量治療組、高劑量治療組、模型組和西藥對照組，每組10只;另設(shè)10只R1系抗快速老化小鼠(senescence accelerated resistantmouse1，SAMR1)為正常對照組。低、中、高劑量治療組均以ICA+PNS灌胃(劑量依次為2.5+

3、20 mg/kg，5+40 mg/kg，10+80mg/kg)，西藥對照組以多奈哌齊灌胃(劑量為1 mg/kg)，模型組和正常對照組以等劑量雙蒸水灌胃。8周后，以Morris水迷宮對各組小鼠進行行為學(xué)測試，分析其學(xué)習(xí)記憶能力的變化;同時，從低、中、高劑量治療組之中篩選出最佳劑量組，作為后續(xù)實驗中的治療組;行為學(xué)測試結(jié)束后，應(yīng)用雙向凝膠電泳技術(shù)分別分離治療組和模型組SAMP8海馬組織總蛋白，以膠體考馬斯亮藍染色，Image Scanner

4、圖像掃描儀及Image Master雙向凝膠電泳軟件對圖像進行掃描分析，以模型組圖像為參照對象，選取治療組中部分差異蛋白質(zhì)點進行基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜分析，得到肽質(zhì)量指紋圖譜，經(jīng)MSDB和NCBInr數(shù)據(jù)庫查詢，鑒定差異表達蛋白質(zhì);采用Westernblot和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription-Polymerase chainreaction，RT-PCR)技術(shù)對部分差異表達蛋白質(zhì)進行驗證，同時檢

5、測這些差異表達蛋白在正常對照組SAMR1海馬組織中的表達水平。
　　結(jié)果: 1.行為學(xué)測試結(jié)果顯示，模型組小鼠的逃避潛伏期較正常對照組明顯延長(P＜0.05)，且停留在原平臺象限的時間和跨平臺象限次數(shù)較正常對照組明顯減少(P＜0.05);與模型組小鼠相比，中劑量治療組、高劑量治療組及西藥對照組小鼠的逃避潛伏期明顯縮短(P＜0.05)，而停留在原平臺象限的時間和跨平臺象限次數(shù)明顯增加(P＜0.05);中劑量治療組、高劑量治療組與西藥

6、對照組小鼠之間的逃避潛伏期及停留在原平臺象限的時間和跨平臺象限次數(shù)均無明顯差異（P＞0.05），據(jù)此認為中劑量組為最佳劑量組。2.以模型組的雙向凝膠電泳圖譜為參照，發(fā)現(xiàn)治療組與模型組存在23個差異點，其中12個在治療組表達上調(diào)，11個表達下調(diào)。選取變化較為明顯、邊界較為清晰、無明顯拖尾現(xiàn)象的差異蛋白質(zhì)點進行鑒定:最終得到鑒定的有12個點，其中有7個在治療組表達上調(diào)，5個表達下調(diào)。根據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中提供的信息，發(fā)現(xiàn)這些差異表達蛋白治療的A

7、D作用機制涉及調(diào)節(jié)Aβ代謝、抑制tau蛋白異常磷酸化、抗氧化應(yīng)激、減輕腦內(nèi)炎癥反應(yīng)、改善線粒體能量代謝障礙、抑制神經(jīng)細胞凋亡等方面。3.差異蛋白驗證結(jié)果:(1) Western blot驗證結(jié)果:本次實驗采用western blot技術(shù)檢測flotillin-1和HMGB1在治療組、模型組、西藥對照組SAMP8及正常對照組SAMR1海馬組織中的表達水平。結(jié)果顯示:與模型組相比，flotillin-1和HMGB1在治療組、西藥對照組、正常

8、對照組的表達明顯下降(P＜0.05)，而二者在治療組與西藥對照組之間的表達水平無明顯差異(P＞0.05)。上述結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)實驗結(jié)果相符。(2) RT-PCR驗證結(jié)果:本次實驗同時采用RT-PCR技術(shù)檢測HMGB1和Ngb在治療組、模型組、西藥對照組SAMP8及正常對照組SAMR1海馬組織中的表達水平。結(jié)果顯示:HMGB1在治療組、西藥對照組及正常對照組的表達較模型組明顯下降(P＜0.05);Ngb在治療組、西藥對照組及正常對照組的表

9、達較模型組明顯增高(P＜0.05);而二者在治療組與西藥對照組之間的表達水平均無明顯差異(P＞0.05)。上述結(jié)果與western blot的結(jié)果一致，亦與蛋白質(zhì)組學(xué)實驗的結(jié)果相符。
　　結(jié)論: 1.ICA聯(lián)用PNS能顯著改善AD模型小鼠SAMP8的學(xué)習(xí)能力及記憶鞏固、再現(xiàn)能力。2.ICA聯(lián)用PNS可調(diào)節(jié)AD模型小鼠SAMP8海馬組織的多種蛋白質(zhì)表達，對AD的治療是多靶點、多途徑的。3.ICA聯(lián)用PNS可能通過調(diào)節(jié)flotilli