毛細(xì)管電泳核酸定量分析及基因突變檢測方法研究.pdf

1、高效毛細(xì)管電泳是八十年代初發(fā)展起來的一種新型分離技術(shù),該技術(shù)具有分離效率高、分析速度快、樣品用量少、高靈敏度、易于自動化等特點,因此在化學(xué)、生命科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、藥學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用.特別是在核酸分析方面,例如PCR產(chǎn)物分析、酶切片段、突變檢測、基因類型以及序列分析等方面,高效毛細(xì)管電泳是一種非常有效的分析工具. 激光誘導(dǎo)熒光檢測是所有檢測方法中靈敏度最高的一種檢測方法.它與毛細(xì)管電泳技術(shù)結(jié)合,成為了一種高靈敏、高選擇性的分析

2、方法,被廣泛地應(yīng)用于微量生物樣品的分析.本論文旨在以毛細(xì)管電泳一激光誘導(dǎo)熒光系統(tǒng)為分析手段,發(fā)展核酸的定量分析和基因突變檢測新方法,主要內(nèi)容如下: (1)毛細(xì)管電泳核酸定量分離分析.毛細(xì)管電泳核酸定量分離分析在臨床診斷、基因突變檢測以及基因序列測定等方面具有廣泛的應(yīng)用,因此建立一種簡單、快速、穩(wěn)定、高靈敏的定量分離分析方法具有重要的應(yīng)用價值.我們系統(tǒng)研究了電泳條件對DNA定量分離分析的影響,建立了核酸定量分析方法.著重研究了三種

3、熒光染料(EvaGreen,SYBR Green I和SYBR Gold)對DNA定量分析的影響.實驗發(fā)現(xiàn)EvaGreen比SYBR Green I和SYBR Gold具有較寬的線性范圍,他們的檢測限并沒有非常明顯的差別.同時我們發(fā)現(xiàn)采用以上三種染料時φX174 DNA片均得到了很好的分離,其中EvaGreenφX174.DNA片段進(jìn)行分離分析時的重現(xiàn)性要稍優(yōu)于SYBR Green I和SYBR Gold兩種染料,在同一天內(nèi)測得遷移時間

4、和峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.24～0.27﹪和3.45～7.59﹪;在連續(xù)三天內(nèi)測得遷移時間和峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.35～1.63﹪和6.72～12.05﹪.我們建立了毛細(xì)管電泳核酸定量分析方法,并成功地用于人的循環(huán)血DNA的定量研究.與其他定量方法相比,該方法具有自動化高、簡單、快速等優(yōu)點. (2)毛細(xì)管區(qū)帶電泳循環(huán)血DNA定量法與實時定量PCR定量法的對照.毛細(xì)管區(qū)帶電泳循環(huán)血DNA定量法與其他定量方法的相關(guān)性一直是

5、我們所非常關(guān)注的問題,因此我們對其進(jìn)行了一系列的評價,并與循環(huán)血DNA定量的"金"標(biāo)準(zhǔn).實時定量PCR的方法作以對照.實驗測得毛細(xì)管區(qū)帶電泳日內(nèi)和日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.19﹪和6.91﹪.同一根涂層毛細(xì)管以及不同涂層毛細(xì)管之間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為5.14﹪和9.02﹪.測得實時定量PCR的線性方程為:y=-3.32x+36.92,其中x值代表起始拷貝數(shù)的對數(shù),v值代表Ct值,其相關(guān)系數(shù)為:R<'2>=0.996,批內(nèi)和批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏

6、差分別為7.3﹪和14.92﹪.我們還同時用三種方法(real-time PCR,CZE<'1>,CzE<'2>)對50個正常人的血清樣品進(jìn)行測定,結(jié)果表明毛細(xì)管區(qū)帶電泳和實時定量PCR兩種方法的相關(guān)性非常好,而且進(jìn)一步證明血樣的采集等處理步驟對循環(huán)血DNA水平有重要的影響. (3)基于逆流衍生基因突變檢測方法研究.我們將逆流衍生標(biāo)記法成功地用于恒變性劑毛細(xì)管電泳以及單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析兩種基因突變檢測方法中.我們分別用SYBR

7、Gold和EvaGreen兩種染料為DNA熒光內(nèi)插試劑,對MTHFR基因的C677T進(jìn)行了突變檢測.系統(tǒng)地研究了實驗條件對突變檢測的影響,選擇4M的尿素和20﹪的甲酰胺作為變性劑,6﹪的線性丙烯酰胺作為篩分介質(zhì).在恒變性劑毛細(xì)管電泳突變檢測中,應(yīng)用兩種染料均得到很好的結(jié)果,對于雜合子樣品得到了兩條同源雙鏈DNA以及兩條異源雙鏈DNA的峰.同時采用柱上衍生法進(jìn)行實驗,發(fā)現(xiàn)對于雜合子樣品得到分離度非常差、熒光信號比較弱的四個峰,更有趣地是在

8、溫度達(dá)到54℃以上時,熒光信號非常弱,不能被檢測器檢測到.熒光標(biāo)記引物是基因突變檢測中應(yīng)用最廣泛的一種標(biāo)記方式,因此我們同時用熒光標(biāo)記引物的方法作了對照實驗;在單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析中,對于雜合子樣品我們得到了四條單鏈DNA的四個峰,純合子樣品得到兩條單鏈的兩個峰,實驗還進(jìn)一步證明EvaGreen這種新型熒光染料還可以應(yīng)用于單鏈DNA的分析.我們的結(jié)果初步表明逆流衍生的柱后標(biāo)記方式可以成功地用于恒變性劑毛細(xì)管電泳以及單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析方法的

9、基因突變檢測. (4)基于MutS蛋白分子識別基因突變檢測方法研究.MutS蛋白是DNA錯配修復(fù)系統(tǒng)的重要組成部分,MutS蛋白能夠識別并結(jié)合八種錯配DNA雙鏈,以及由堿基修飾引起的錯配,還能識別結(jié)合1-4個核苷酸插入或缺失形成的loop環(huán)結(jié)構(gòu).多種基于MutS蛋白分子識別基因突變/多態(tài)性的檢測技術(shù),相對比較復(fù)雜,而且成本比較高.為此我們償試用毛細(xì)管電泳.激光誘導(dǎo)熒光的系統(tǒng)對基于MutS分子識別基因突變及多態(tài)性進(jìn)行初步探索.實驗