無膠篩分毛細(xì)管電泳檢測基因突變的方法學(xué)研究及其在胃癌中的應(yīng)用.pdf

1、基因突變與腫瘤發(fā)生有著較高的相關(guān)性，所以探索研究新的、靈敏度高的檢測基因突變的方法是相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜夜餐P(guān)注的熱點(diǎn)問題，也是交叉學(xué)科。目前幾乎所有的基因突變檢測都是建立于PCR基礎(chǔ)之上，操作簡便準(zhǔn)確率高的基因分析技術(shù)限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)常與其結(jié)合用于基因突變的檢測，但結(jié)果往往需要借助電泳技術(shù)顯示，而傳統(tǒng)的平板凝膠電泳分辨率低、分析時間長，不能很好的用于各種長度DNA片段尤其是小片段的多態(tài)性分析。隨著與高效毛細(xì)管電泳技術(shù)(CE)聯(lián)

2、合在分子生物學(xué)中的廣泛應(yīng)用，使得RFLP-CE具備了檢測靈敏度高、分離度高和檢測效率高的特點(diǎn)。建立高效的檢測基因突變方法，可為臨床腫瘤的準(zhǔn)確診斷和預(yù)警提供更為科學(xué)的技術(shù)和方法。本論文以此為目的探索建立了一套適用于RFLP技術(shù)的毛細(xì)管電泳分析分離體系用于臨床胃癌組織基因突變檢測，系統(tǒng)考察了毛細(xì)管電泳體系中不同篩分介質(zhì)分離不同大小和范圍的DNA片段的能力。 本論文共分為三部分，第一部分毛細(xì)管電泳在基因突變及多態(tài)性分析中的研究背景，第

3、二部分是毛細(xì)管無膠篩分電泳中不同篩分介質(zhì)對DNA分離的方法學(xué)研究，第三部分是選擇合適的毛細(xì)管電泳分離體系聯(lián)合RFLP檢測胃癌組織中p53基因和ras基因點(diǎn)突變，并探討p53基因和ras基因點(diǎn)突變在胃癌發(fā)生的作用和地位。 第一部分研究背景介紹，主要綜述了胃癌發(fā)生相關(guān)基因p53和ras基因及異?；驒z測方法研究進(jìn)展，毛細(xì)管電泳研究背景主要集中在篩分機(jī)理、篩分介質(zhì)、毛細(xì)管涂層技術(shù)和其他一些影響電泳的因素以及毛細(xì)管電泳在基因突變及多態(tài)性

4、分析方面的應(yīng)用進(jìn)展等。 第二部分毛細(xì)管無膠篩分電泳(NGS-CE)中不同篩分介質(zhì)對DNA分離的方法學(xué)研究，目的是通過系統(tǒng)考察不同篩分介質(zhì)分離不同大小和范圍DNA片段的能力，建立一套適用不同大小的基因雙鏈分離體系。首先應(yīng)用甲基纖維素(MC)為篩分介質(zhì)并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室成熟的毛細(xì)管共價涂層技術(shù)，考察了對pUC19 DNA/MspⅠ(HpaⅡ)DNAMarker、PBR322/BsuRI DNA Marker和FastRulerTM DN

5、A Ladder的分離情況，系統(tǒng)研究了MC濃度、溫度、分離電壓、篩分介質(zhì)pH等因素對雙鏈DNA分離的影響，結(jié)果表明MC是一種良好的篩分介質(zhì)，能成功分離上述三種不同的DNA片段；其次，應(yīng)用具有動態(tài)涂層能力的分子量相對較小的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚環(huán)氧乙烷(PEO)為篩分介質(zhì)在空毛細(xì)管柱中考察了對pUC19 DNA/Msp Ⅰ(HpaⅡ)DNA Marker、PBR322/BsuRI DNA Marker和FastRulerTM DNA

6、 Ladder的分離情況，結(jié)果表明PVP分離puC19 DNA/MspⅠ(HpaⅡ)DNA Marker、PBR322/BsuRI DNA Marker的效果不佳，而分離FastRulerTM DNA Ladder能夠獲得很高的分離度；PEO能很好的分離pUC19DNA/MspⅠ(HpaⅡ)DNA Marker和FastRulerTM DNA Ladder。建立的這一套雙鏈DNA片段分離體系最終可以達(dá)到同時分離10bp～600bp的雙鏈

7、DNA，符合RFLP分析基因突變的要求。 第三部分應(yīng)用已經(jīng)建立的無膠篩分毛細(xì)管電泳分離體系與PCR-RFLP技術(shù)相結(jié)合用于胃癌組織p53基因175位、245位密碼子和H-ras、K-ras基因12位密碼子突變情況的同時檢測。提取了59例胃癌患者及癌旁正常組織的基因組DNA，經(jīng)測定DNA濃度適中，純度較好。利用PCR擴(kuò)增出相應(yīng)的目的片段，使用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，排除了PCR產(chǎn)物中離子和引物二聚體對后

8、續(xù)研究的干擾，擴(kuò)增的目的片段中，有的片段較小不能進(jìn)行純化。相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶切割純化的PCR產(chǎn)物，然后應(yīng)用毛細(xì)管電泳分離體系(篩分介質(zhì)為2.0％MC，pH8.0，分離電壓7.5kV，電泳溫度25℃)分析臨床59例胃癌患者p53和ras基因擴(kuò)增產(chǎn)物的限制性片段長度多態(tài)性。20min內(nèi)檢測了各個基因不同位點(diǎn)的突變情況。初步建立了快速、高分辨率診斷胃癌的方法。結(jié)果顯示胃癌的p53基因點(diǎn)突變率為20.51％(8/39)，ras基因點(diǎn)突變率為11

9、.11％(5/45)。其中p53基因175位密碼子有5例發(fā)生突變(5/39，12.82％)，245位密碼子有3例發(fā)生突變(3/39，7.69％)，H-ras基因有1例發(fā)生突變(1/45，2.22％)，K-ras基因有4例發(fā)生突變(4/45，8.89％)，只有在2例中同時發(fā)現(xiàn)p53和ras基因發(fā)生突變。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，p53基因突變和發(fā)生部位無明顯相關(guān)性，ras基因的突變主要集中在胃體和胃底賁門。p53和ras基因在胃癌和胃癌組織不同病理分