膜型、可溶性Tim-3在抗腫瘤免疫應答中的作用及腫瘤基因治療的研究.pdf

1、Tim-3(T-cellimmunoglobulin-andmucin-domain-containgmolecule)分子的發(fā)現(xiàn)是源于尋找區(qū)分TH1細胞和TH2細胞的表面標志物。對其功能的研究揭示Tim-3在自身免疫性疾病和器官移植排斥反應性疾病中具有重要的免疫學作用。應用Tim-3的抗體和Tim-3-Ig融合蛋白能夠影響免疫反應，加速疾病的發(fā)展。隨后的研究發(fā)現(xiàn)編碼Tim-3分子的基因通過選擇性剪切產(chǎn)生一長一短兩種形式的mRNA剪切體

2、。長的mRNA指導生成膜型Tim-3(簡稱Tim-3)，膜型Tim-3由信號肽、IgV區(qū)和黏液區(qū)、跨膜區(qū)以及胞質(zhì)區(qū)組成;短的mRNA指導生成包含信號肽、IgV區(qū)和胞質(zhì)區(qū)的蛋白質(zhì)，由于缺少黏液區(qū)，因此推測短的mRNA編碼生成的蛋白質(zhì)可能是可溶性的分子(sTim-3，solubleTim-3)，但是目前缺乏直接的實驗證據(jù)證實sTim-3蛋白分子的存在。 許多重要的膜型免疫調(diào)控分子如CD86、Fas、CTLA-4都有天然的可溶性的對照

3、物。而且這些可溶性的對照物在免疫應答反應中也發(fā)揮重要的作用。Tim-3兩種形式的mRNA剪切體的發(fā)現(xiàn)向我們提出以下幾個方面的問題：(1)在免疫反應中Tim-3和sTim-3mRNA的表達規(guī)律。(2)短的Tim-3mRNA的是否指導生成sTim-3，sTim-3是否具有生物活性。(3)sTim-3和Tim-3在腫瘤免疫應答中的作用及可能的作用機制。 本研究的第一部分和第二部分試圖回答以上幾個方面的問題。 本論文的第三部分的

4、內(nèi)容是有關克服腫瘤免疫逃避基因治療的研究。目前，以提高機體抗腫瘤免疫反應為主的治療措施受到廣泛的關注。但是，近年研究發(fā)現(xiàn)：受到免疫攻擊的腫瘤細胞會迅速上調(diào)表達免疫負性共刺激分子-B7-H1(又被稱為PD-L1)。B7-H1能夠同表達在活化的T淋巴細胞表面的免疫抑制性受體PD-1(programdeath-1)結(jié)合進而抑制T淋巴細胞的殺傷作用。因此，腫瘤細胞表達B7-H1能夠促進腫瘤的免疫逃逸。我們采用本研究小組構建的可溶性的PD-1(s

5、PD-1，solublePD-1，)封閉瘤細胞表面的B7-H1，聯(lián)合HSP70-腫瘤抗原肽復合物能有效抑制肺部轉(zhuǎn)移性腫瘤。我們還探討了聯(lián)合應用的可能作用機制，希望能為制定有效的腫瘤免疫治療方案提供理論基礎和實驗依據(jù)。 第一部分 異位表達Tim-3促進抗腫瘤免疫應答反應 目的：在腫瘤局部組織微環(huán)境中轉(zhuǎn)染表達Tim-3，并研究Tim-3在調(diào)節(jié)淋巴細胞功能活性及抗腫瘤方面的作用和機制。方法：提取鼠脾臟總RNA，RT-P

6、CR擴增出Tim-3編碼序列，限制性內(nèi)切酶消化，回收目的片斷并插入到pcDNA3.1相應多克隆位點上。構建含有Tim-3全長cDNA序列的真核表達質(zhì)粒，脂質(zhì)體介導體外轉(zhuǎn)染CHO細胞，G418篩選出陽性克隆，流式細胞儀分析Tim-3的表達。建立小鼠H22肝細胞癌移植瘤模型，腫瘤組織內(nèi)注射pTim-3真核表達質(zhì)粒，RT-PCR、免疫組織化學法檢測在腫瘤細胞內(nèi)Tim-3表達情況。并觀察腫瘤的生長速度和荷瘤鼠的生存期。另外，利用H&E染色法分析

7、瘤組織中淋巴細胞浸潤情況。分離脾細胞體外測淋巴細胞的殺傷作用。流式細胞儀檢測分析Tim-3在新鮮分離的CD3+T細胞和CD8+T細胞和接受HSP70-腫瘤抗原肽刺激的CD3+T細胞和CD8+T細胞表面的表達情況。結(jié)果：限制性酶切分析及序列測定證實成功構建了小鼠Tim-3真核表達質(zhì)粒pTim-3。FACS檢測分析顯示轉(zhuǎn)染pTim-3質(zhì)粒的CHO細胞在表面表達Tim-3抗原。RT-PCR、免疫組織化學法檢測腫瘤接種部位能夠表達Tim-3mR

8、NA和Tim-3抗原。同生理鹽水對照組和空載體對照組相比，腫瘤接種部位轉(zhuǎn)染表達Tim-3，能顯著抑制腫瘤生長速率并明顯延長荷瘤鼠的生存期。H&E染色顯示有大量的淋巴細胞浸潤。接受pTim-3治療的小鼠的脾細胞殺傷活性明顯增強。流式細胞儀檢測分析顯示新鮮分離的CD3+T和CD8+T細胞幾乎不表達Tim-3。然而，接受腫瘤抗原肽刺激的CD3+T和CD8+T細胞表面表達Tim-3。而且隨著刺激次數(shù)的增加，CD3+T和CD8+T細胞上調(diào)表達Ti

9、m-3。結(jié)論：在腫瘤微環(huán)境中轉(zhuǎn)染表達Tim-3，能夠有效地促進淋巴細胞的抗腫瘤活性。Tim-3除去表達在活化的CD4+T細胞表面，也可以表達在活化的CD8+T表面細胞。 第二部分 可溶性Tim-3抑制T淋巴細胞的免疫應答反應 首先，我們闡明了Tim-3mRNA表達在骨髓細胞，胸腺細胞和脾細胞中，而sTim-3mRNA僅表達在脾細胞中，而骨髓細胞，胸腺細胞和其它非免疫組織細胞不表達sTim-3mRNA。我們采用Re

10、al-TimePCR的方法研究新鮮分離的脾細胞和接受刺激的脾細胞表達兩型Tim-3mRNA的表達情況。Real-TimePCR的結(jié)果顯示新鮮分離的脾細胞主要表達Tim-3mRNA，而接受刺激的脾細胞主要表達sTim-3mRNA。提示Tim-3和sTim-3mRNA的表達與脾細胞的免疫狀態(tài)有關。 然后，我們用Westernblot的方法證實sTim-3蛋白質(zhì)分子存在于接受刺激的脾細胞的分泌液中。并且轉(zhuǎn)染了sTim-3真核表達質(zhì)粒的

11、CHO細胞分泌液中也存在sTim-3蛋白質(zhì)分子。熒光檢測顯示轉(zhuǎn)染Tim-3-GFP真核表達質(zhì)粒的CHO細胞顯示綠色熒光。而轉(zhuǎn)染sTim-3-GFP真核表達質(zhì)粒的CHO細胞幾乎不顯示綠色熒光。間接提示sTim-3-GFP以可溶性蛋白的形式被分泌到細胞外。用轉(zhuǎn)染sTim-3-GFP真核表達質(zhì)粒的CHO細胞的上清液同T細胞共孵育。FACS檢測顯示T細胞表面的熒光強度明顯高于對照組。證實sTim-3能夠和T細胞表面的配體結(jié)合。 體外的實

12、驗結(jié)果顯示sTim-3能夠抑制anti-CD3和anti-CD28的刺激淋巴細胞增殖激作用。并且sTim-3同樣能夠抑制HSP70-腫瘤抗原肽復合物的特異性抗原刺激作用。應用Tim-3的抗體后能夠阻斷sTim-3抑制淋巴細胞增殖激作用。ELISA檢測細胞因子的結(jié)果顯示：sTim-3能明顯抑制IL-2、IFN-γ的分泌，但不影響IL-4的分泌。我們進一步采用腫瘤排斥模型研究sTim-3在體內(nèi)的免疫學活性。結(jié)果顯示，腫瘤細胞在接受sTim-

13、3治療的小鼠體內(nèi)生長更快一些，荷瘤鼠的存活期明顯縮短。和對照組比，接受sTim-3治療的小鼠的脾細胞增殖能力和殺傷活性明顯降低。病理和免疫組化檢測結(jié)果顯示接受sTim-3治療的瘤組織內(nèi)浸潤T淋巴細胞的數(shù)目明顯低于對照組。證實sTim-3在體內(nèi)抑制T細胞的抗腫瘤免疫應答反應。 我們的研究還試圖理解sTim-3影響T細胞免疫應答反應的作用機制。因為CD4+CD25-T效應細胞和CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細胞都表達Tim-3的配體。因此

14、，sTim-3抑制T細胞的抗腫瘤免疫應答反應可能是通過抑制CD4+CD25-T效應細胞的活化，或者促進CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細胞的活化。為了回答這個問題。我們采用Real-TimePCR的方法研究反應CD4+CD25-T效應細胞和CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細胞活性狀態(tài)的免疫分子表達情況。結(jié)果顯示，sTim-3能夠抑制與CD4+CD25-T效應細胞功能相關的細胞因子的表達，比如IL-2、IFN-γ、TNF-β。但不影響與CD4+CD25+