內(nèi)皮素-1、NF-κB及AP-1在高糖誘導系膜細胞表達纖維連接蛋白中的作用.pdf

1、糖尿病腎病(diabeticnephropathy,DN)是一種主要的糖尿病(diabetesmellitus，DM)微血管并發(fā)癥，它是遺傳因素與長期高血糖等環(huán)境因素相互作用的結(jié)果，是DM常見和嚴重的慢性并發(fā)癥之一，其特征性的病理變化為腎小球基底膜增厚、系膜細胞肥大增生、細胞外基質(zhì)(Extracellularmatrix，ECM)積聚增加及腎小球硬化，導致這些特征性病理變化的機制尚不完全清楚。內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-

2、1)是一種具有很強血管活性的細胞因子，近年來成為研究DN發(fā)病機制中的熱點之一。ET-1具有廣泛的組織分布和生物學作用，在一些研究中證實可以促進纖維連接蛋白(fibronectin,FN)的表達。NF-κB、AP-1作為具有多向性調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子，參與多種靶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，進而介導機體的多種病理生理過程。有研究證實，ET-1、NF-κB和AP-1參與調(diào)控高葡萄糖(highglucose,HG)誘導的血管內(nèi)皮細胞ET-1和ECM表達增加。在

3、體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細胞(glomerularmesangialcell，GMC)中，ET-1、NF-κB和AP-1是否也參與調(diào)控高葡萄糖誘導的ECM表達尚不清楚。 本研究用體外培養(yǎng)的大鼠GMC，探討高葡萄糖對其ET-1及FNmRNA及蛋白表達的影響以及ET-1受體拮抗劑PD142893，NF-κB抑制劑PDTC及JNK抑制劑SP600125在GMC表達ET-1及FN中的作用，從而探討ET-1、NF-κB及AP-1在高葡萄糖

4、誘導的大鼠腎小球系膜細胞ECM表達中的作用及可能的信號轉(zhuǎn)導途徑，為尋求新的DN防治靶目標提供理論依據(jù)。 1.高濃度葡萄糖對大鼠GMC增殖的影響 我們首先觀察了正常濃度葡萄糖(D-glucose，5.6mmol/L)、高濃度葡萄糖(D-glucose，30.0mmol/L)及高滲透壓(D-glucose，5.6mmol/L+D-mannitol，24.4mmol/L)三種不同的培養(yǎng)條件對大鼠GMC增殖的影響。顯微鏡下觀察到

5、HG組MC1097體外培養(yǎng)達到完全融合時所需時間較NG組延長，MTT法測得NG組OD570為0.73±0.18，HG組OD570為0.57±0.10，與NG組比較，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)；OC組OD570為0.62±0.13，與NG組和HG組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。結(jié)果提示高濃度葡萄糖可以顯著抑制大鼠GMC增殖，高滲透壓也可以抑制大鼠GMC增殖，但作用不如高濃度葡萄糖顯著。 2.高濃度葡萄糖對培養(yǎng)大

6、鼠GMC表達ET-1和FN的時間過程。 為了確定培養(yǎng)時間對大鼠GMC表達ET-1和FN的影響以及本研究中大鼠GMC體外培養(yǎng)的合適時間，我們在mRNA及蛋白水平檢測高濃度葡萄糖培養(yǎng)條件下，大鼠GMC表達ET-1和FN的時間過程。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在高糖條件下培養(yǎng)0h、12h、24h、36h及48h后，ET-1mRNA相對表達量分別為100、154.8±9.1、181.8±9.5、200.6±20.3和213.9±28.6，蛋白表達分別為(2

7、3.1±6.1)pg/mL、(39.7±5.7)pg/mL、(56.3±7.0)pg/mL、(65.5±8.4)pg/mL和(69.2±5.5)pg/mL；FN的mRNA相對表達量分別為100、153.3±9.1、198.2±6.8、217.4±7.8和232.6±7.6，蛋白表達分別為(33.9±3.1)ng/mL、(57.5±5.0)ng/mL、(76.2±6.4)ng/mL、(84.7±5.7)ng/mL和(94.9±7.3)ng

8、/mL。與0h比較，高糖培養(yǎng)24h后ET-1mRNA和蛋白水平表達分別增加81％及144％(p＜0.01)，F(xiàn)NmRNA和蛋白水平表達分別增加98％及125％(p＜0.01)。結(jié)果提示高濃度葡萄糖培養(yǎng)條件下，大鼠GMC表達ET-1和FN呈時間依賴性。24h可以作為本研究中大鼠GMC體外培養(yǎng)的合適時間。 3.高濃度葡萄糖及ET-1對大鼠GMC表達FN的作用 我們用RT-PCR法及ELISA法分別在mRNA水平和蛋白水平檢測

9、高濃度葡萄糖及ET-1對大鼠GMC表達FN的作用。研究發(fā)現(xiàn)，HG組與NG組比較，ET-1在mRNA水平表達增加77％(p＜0.01)，蛋白水平表達由(21.6±3.1)pg/mL增至(59.6±5.2)pg/mL(p＜0.01)；FN在mRNA水平的表達增加74％(p＜0.01)，蛋白水平表達由(32.4±4.6)ng/mL增加至(86.5±12.7)ng/mL(p＜0.01)。NG組加入ET-1(5nmol/L)后，F(xiàn)N在mRNA水平

10、表達增加143％(p＜0.01)，蛋白水平表達由(32.4±4.6)ng/mL增加至(79.1±11.6)ng/mL(p＜0.01)。加入ET-1受體拮抗劑PD142893(10μmol/L)后，高糖誘導的FN表達在mRNA水平被抑制35％(p＜0.01)，蛋白水平表達由(86.5±12.7)ng/mL降至(35.0±7.4)ng/mL(p＜0.01)；ET-1誘導的FN表達在mRNA水平被抑制52％(p＜0.01)，蛋白水平表達由(7

11、9.1±11.6)ng/mL降至(36.1±6.6)ng/mL(p＜0.01)。結(jié)果說明，在體外培養(yǎng)的大鼠GMC中，高濃度葡萄糖可以顯著增強ET-1和FN表達，同時，ET-1可以模擬高濃度葡萄糖的作用增強FN表達，高濃度葡萄糖和ET-1增強FN表達的作用可被ET受體拮抗劑所抑制。 4.NF-κB及AP-1在大鼠GMC表達ET-1及FN中的作用 我們在體外培養(yǎng)的大鼠GMC中觀察NF-κB抑制劑PDTC(10μmol/L)及

12、JNK抑制劑SP600125(10μmol/L)對ET-1及FN表達的影響。研究發(fā)現(xiàn)，PDTC及SP600125對ET-1的表達無明顯影響(p＞0.05)。給予PDTC后，高濃度葡萄糖誘導的FNmRNA表達可被抑制42％(p＜0.01)，蛋白表達水平由(86.5±12.7)ng/mL降至(34.2±2.9)ng/mL(p＜0.01)，ET-1誘導的FNmRNA表達可被抑制50％(p＜0.01)，蛋白表達水平由(79.1±11.6)ng/

13、mL降至(33.0±4.5)ng/mL(p＜0.01)；給予SP600125后，高濃度葡萄糖誘導的FNmRNA表達可被抑制30％(p＜0.01)，蛋白表達水平由(86.5±12.7)ng/mL降至(34.0±6.3)ng/mL(p＜0.01)，ET-1誘導的FNmRNA表達可分別被抑制45％(p＜0.01)，蛋白表達水平由(79.1±11.6)ng/mL降至(37.0±3.2)ng/mL(p＜0.01)。結(jié)果說明，在體外培養(yǎng)的大鼠GMC

14、，NF-κB、AP-1不參與調(diào)控高濃度葡萄糖誘導的ET-1表達增加，但在高濃度葡萄糖和ET-1誘導的FN表達增加中發(fā)揮著重要作用。 結(jié)論：1.高濃度葡萄糖抑制大鼠腎小球系膜細胞增殖。高糖誘導的內(nèi)皮素-1和纖維連接蛋白的表達增加不是由細胞增殖引起。 2.高濃度葡萄糖增強大鼠腎小球系膜細胞內(nèi)皮素-1和纖維連接蛋白的表達，且這種增強作用呈時間依賴性。 3.內(nèi)皮素-1可以模擬高濃度葡萄糖增強大鼠腎小球系膜細胞表達纖維連接

15、蛋白的作用，高濃度葡萄糖和內(nèi)皮素-1增強大鼠腎小球系膜細胞表達纖維連接蛋白的作用可以被內(nèi)皮素受體拮抗劑所抑制。提示高濃度葡萄糖增強大鼠腎小球系膜細胞表達纖維連接蛋白的作用是通過內(nèi)皮素-1介導的 4.NF-κB抑制劑PDTC及JNK抑制劑SP600125不能抑制高濃度葡萄糖誘導的大鼠腎小球系膜細胞內(nèi)皮素-1表達增加。但可以抑制高濃度葡萄糖和內(nèi)皮素-1誘導的大鼠腎小球系膜細胞纖維連接蛋白表達增加。提示在高濃度葡萄糖條件下培養(yǎng)的大鼠腎