α-,v-β-,3-整合素受體靶向性超順磁性脂質(zhì)體的合成及腫瘤血管靶向磁共振成像研究.pdf

1、目的： αvβ3整合素受體過表達(dá)于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，在腫瘤血管生成中發(fā)揮重要作用，可被視為腫瘤特異性標(biāo)記物。通過對(duì)該受體的特異性標(biāo)記，有望早期、特異性診斷腫瘤。本研究合成表面連接RGD短肽序列為親和成分的靶向性超順磁性長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體，并通過體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)MRI成像確定其受體靶向性，探討早期腫瘤血管靶向性診斷的可能性。 材料與方法： 我們采用薄膜法分別合成表面連接和不連接RGD的靶向性和非靶向性長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體，其

2、內(nèi)水相分別包裹超順磁性氧化鐵納米顆粒(Superparamagnetic Iron Oxide，SPIO)和鈣黃綠素。測(cè)量其包封率、粒徑大小、弛預(yù)率，透射電鏡觀察SPIO包封情況。 靶向性研究部分采用流式細(xì)胞分析及共聚焦激光掃描顯微鏡觀察。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)培養(yǎng)及傳代，制備細(xì)胞懸液備用。將細(xì)胞分為四組：一組加入靶向性長(zhǎng)循環(huán)熒光脂質(zhì)體(實(shí)驗(yàn)組

3、)；一組加入非靶向性長(zhǎng)循環(huán)熒光脂質(zhì)體(對(duì)照組)；空白對(duì)照組僅加入PBS緩沖液；競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)部分，先給予過量RGD(約10倍濃度)，然后加入靶向性長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體。反應(yīng)約1小時(shí)后，用流式細(xì)胞儀測(cè)量陽性細(xì)胞百分比、幾何平均熒光強(qiáng)度等。 共聚焦激光掃描顯微鏡實(shí)驗(yàn)部分。HUVEC置于預(yù)先放有蓋玻片的六孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中過夜，細(xì)胞爬片備用。載有細(xì)胞的蓋玻片分別與靶向性、非靶向性長(zhǎng)循環(huán)熒光脂質(zhì)體反應(yīng)約1小時(shí)，反應(yīng)分別在4℃、37℃下進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)

4、洗滌、固定后，共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞熒光標(biāo)記情況。 所有實(shí)驗(yàn)過程中注意避光。 隨后進(jìn)行兔Vx2腫瘤模型體內(nèi)MRI成像研究。于雙側(cè)兔后腿皮下建立荷瘤模型，分別經(jīng)耳緣靜脈注入靶向性超順磁性長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體、非靶向性超順磁性長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體，鐵含量約3mg/kg。進(jìn)行MRI掃描，測(cè)量給藥前、給藥后不同時(shí)間段腫瘤及周邊肌肉信號(hào)變化情況，計(jì)算對(duì)比噪聲比。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死動(dòng)物，腫瘤標(biāo)本進(jìn)行HE、普魯士藍(lán)染色，光鏡觀察，確定靶向性造影劑中鐵的分布

5、與腫瘤血管的關(guān)系。 所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，行單因素方差分析，以p≦0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。p≦0.01為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 靶向性超順磁性長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體、非靶向性超順磁性長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的粒徑分別為144、147nm，兩者粒徑分布均勻。靶向性脂質(zhì)體的磁性粒子包封率為0.27mg/mL，普通長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體為0.28mg/mL。RGD短肽與脂質(zhì)體的偶連率為74.97％。靶向性脂質(zhì)體的弛預(yù)率為1769 mM

6、—1s—1，非靶向脂質(zhì)體的弛預(yù)率為1356 mM—1s—1。超順磁性長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體可以顯著縮短質(zhì)子的T2弛預(yù)時(shí)間(P<0.001)。透射電鏡證實(shí)鐵顆粒包封在脂質(zhì)體內(nèi)。 流式細(xì)胞研究結(jié)果表明靶向組、非靶向組、競(jìng)爭(zhēng)組及空白對(duì)照組細(xì)胞陽性率平均分別為76.15％、10.81％、18.96％及0.37％，靶向組明顯高于其他各組(P≦0.002)。幾何均數(shù)熒光強(qiáng)度靶向組(128.71)也遠(yuǎn)高于非靶向組(36.71)及競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)組(39.78)

7、(P<0.001)。競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞陽性率、熒光強(qiáng)度與非靶向組接近。共聚焦研究靶向組可見明顯細(xì)胞染色，4℃時(shí)熒光染色位于細(xì)胞膜，37℃熒光染色主要位于細(xì)胞質(zhì)。非靶向組細(xì)胞在4℃、37℃均未見明顯染色。 體內(nèi)MRI成像顯示靶向組于腫瘤周邊及血管周邊可見信號(hào)減低，信號(hào)改變發(fā)生較慢，15小時(shí)后信號(hào)降至最低(P<0.05)，隨后開始升高；非靶向組給藥后很快出現(xiàn)信號(hào)減低，至2小時(shí)降至最低(P<0.05)，隨后信號(hào)開始逐漸升高。腫瘤對(duì)比噪聲比