αv-整合素超聲分子成像可視化評價(jià)基質(zhì)膠血管新生.pdf

1、背景和目的：
　　 血管新生(angiogenesis)是指在機(jī)體生長發(fā)育過程中或創(chuàng)傷修復(fù)、缺血缺氧和炎癥等情況下,原有微血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell,EC)經(jīng)過生芽、遷移、增殖與基質(zhì)重塑等形成新毛細(xì)血管的過程。在組織再生、發(fā)育和創(chuàng)傷修復(fù)過程中,血管形成是一個(gè)基本的生理過程,如各種創(chuàng)傷、潰瘍、心肌梗塞、慢性感染等愈合過程都需要血管形成的參與,但是在許多病理狀態(tài)下也存在血管生成失調(diào),例如糖尿病視網(wǎng)膜病、動脈硬化和

2、實(shí)體腫瘤等嚴(yán)重危害人類健康的疾病中。
　　 本文通過分別向基質(zhì)膠中加入不同量的FGF-2,建立基質(zhì)膠血管新生模型,并通過單抗封閉新生血管αv-整合素分子靶點(diǎn)的方法建立陰性對照模型,旨在探討攜帶αv-整合素分子探針的超聲分子成像評價(jià)不同濃度堿性成纖維細(xì)胞生長因子(FGF-2)介導(dǎo)的血管新生,并對血管新生的定量化評價(jià)進(jìn)行初步的研究。
　　 材料和方法：
　　 1、超聲微泡的制備:各種脂質(zhì)材料按一定比例75℃水浴溶解于

3、適量蒸餾水中,同時(shí)通全氟丙烷(C3F8)氣體,超聲振蕩至形成乳白色液體制備生物素(Biotin)化脂質(zhì)微泡。生物素化脂質(zhì)微泡經(jīng)靜置棄下清液并加入等量蒸餾水去除未結(jié)合脂質(zhì)純化4次后,按一定比例加入抗生蛋白鏈菌素/親和素(streptavidin)。繼續(xù)靜置棄下清液并加入等量蒸餾水去除未結(jié)合抗生蛋白鏈菌素純化微泡2次后得到外殼結(jié)合有抗生蛋白鏈菌素的脂質(zhì)微泡,再按一定比例加入生物素化鼠抗人αv-整合素單抗(Biotin conjugated

4、mouse Anti-humun αvMonoclone Antibody)得到攜帶抗αv-整合素單抗靶向微泡(MBα),最后靜置棄下清液并加入等量蒸餾水去除未結(jié)合抗體,純化攜帶抗αv-整合素單抗靶向微泡(MBα)2次。用上述方法構(gòu)建攜同型抗體微泡作為對照微泡(MBc)。MBα和MBc均于冰箱中4℃保存?zhèn)溆?。采用庫爾特?jì)數(shù)儀測量MBα及MBc的平均粒徑及濃度。
　　 2、MBα的體外鑒定:采用綠色熒光標(biāo)記的二抗與抗αv-整合素單

5、抗結(jié)合,熒光顯微鏡下觀察抗αv-整合素單抗與微泡的連接情況。采用平行板流動腔技術(shù)在體外模擬的生理血流條件下評價(jià)MBα與αv-整合素Fc段(Recombinant humanαv-vintegrin/Fc Chimera,αvvSFc)的靶向黏附效能。
　　 3、基質(zhì)膠模型的制備:在昆明小鼠皮下注射基質(zhì)膠以促進(jìn)血管新生,分別向基質(zhì)膠中添加不同量的FGF-2(sigma公司),配成濃度為1μg/mL和0.5μg/mL的兩種基質(zhì)膠,并

6、加入肝素(64U/mL)。將20只小鼠隨機(jī)分為2組,分別注射兩種濃度的基質(zhì)膠。20只昆明小鼠經(jīng)常規(guī)麻醉后,在左側(cè)腹部皮下注射0.6ml基質(zhì)膠,在基質(zhì)膠注射部位形成橢圓形隆起。
　　 4、CEU檢查:在注射基質(zhì)膠10天后,將小鼠麻醉后進(jìn)行對比超聲檢查。將自制水囊放在小鼠的左側(cè)腹部,用自制支架固定超聲探頭(17L5)于水囊上。調(diào)整探頭位置獲得良好圖像后保持探頭位置在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中不變,儀器的各項(xiàng)參數(shù)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中保持不變。CEU采

7、用經(jīng)尾靜脈微泡彈丸式注射法進(jìn)行,超聲造影采用經(jīng)尾靜脈隨機(jī)(間隔30min)先后注射MBα和MBc(約為5×106個(gè))。經(jīng)過6min循環(huán)時(shí)間待血池中循環(huán)微泡消失后對實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行注射基質(zhì)膠的部位進(jìn)行CEU檢查,獲取顯影圖像。CEU檢查采用二次諧波成像(second harmonicimaging)技術(shù)進(jìn)行,探頭發(fā)射和接收頻率分別為7 MHz和14MHz,機(jī)械指數(shù)(Mechanical Index,MI)為0.18,超聲發(fā)射間隔(Pulsin

8、g Interval,PI)時(shí)間設(shè)定為10s,獲取第一幀CEU圖像后給予高M(jìn)I(1.9)連續(xù)超聲發(fā)射2～3s以破壞微泡,繼續(xù)存儲本底圖像4～5幀,全部聲學(xué)造影圖像存于CD盤,以備脫機(jī)分析。采用MCE軟件分析CEU圖像,測量實(shí)驗(yàn)小鼠注射基質(zhì)膠的部位顯影的聲強(qiáng)度(videointensity,VI)數(shù)值并制作彩色編碼圖。采用紅色、橙色和白色分別代表基質(zhì)膠顯影程度由強(qiáng)到弱。
　　 5、病理學(xué)檢查和免疫組化檢查:完成CEU圖像采集后,取

9、出實(shí)驗(yàn)小鼠基質(zhì)膠,10％甲醛固定,行病理學(xué)和免疫熒光檢查。
　　 6、平均熒光強(qiáng)度(median fluorescence:intensity,MFI)測定和血管計(jì)數(shù)(microvessel count,MVC):在熒光照片選取相同面積的50個(gè)區(qū)域,使用Imagepro plus6.0軟件分析平均熒光強(qiáng)度。
　　 ①得到灰度圖片；
　　 ②黑白反相；
　　 ③光密度校正；
　　 ④在count/s

10、ize中選擇強(qiáng)度閾值10-200,過濾掉明亮的雜質(zhì)熒光點(diǎn)；
　　 ⑤選擇面積area與積分光密度(IOD)過濾值30像素:
　　 ⑥IOD/area得到該區(qū)域像素的平均灰度,即代表平均熒光強(qiáng)度,然后計(jì)算這50個(gè)區(qū)域的平均值。
　　 單位面積血管計(jì)數(shù):在上述50個(gè)區(qū)域,以有管腔結(jié)構(gòu)為準(zhǔn),進(jìn)行血管計(jì)數(shù),計(jì)算單位面積血管計(jì)數(shù)。
　　 結(jié)果：
　　 1、微泡制備情況:采用庫爾特計(jì)數(shù)儀測得MBc粒徑為2.1

11、2±1.13μm,濃度約為2.80～4.56×108個(gè)/ml；MBα粒徑2.08±0.65μm,濃度約為3.07～4.75×108個(gè)/ml。
　　 2、MBα體外鑒定結(jié)果:采用綠色熒光標(biāo)記的二抗與抗αv-整合素單抗結(jié)合,熒光顯微鏡下觀察顯示MBα外殼顯明顯綠色熒光,表明抗αv-整合素單抗與微泡外殼連接效果良好。平行板流動腔體外評價(jià)結(jié)果顯示,在模擬微血管生理血流條件的剪切應(yīng)力(<1.0dyn/cm2)下MBα可與包被于平行板流動腔

12、的αvSFe有效結(jié)合,顯示了很好的主動性靶向黏附效能。
　　 3、超聲造影檢查:MBα注射后基質(zhì)膠外周帶及周圍組織均可見明顯的超聲顯影,而基質(zhì)膠中心部位未見超聲顯影,6min后周圍組織未見顯影,而基質(zhì)膠外周帶仍可見明顯的超聲顯影,MBc注射后顯影情況與MBα基本相同,但6min后基質(zhì)膠未見明顯的超聲顯影。預(yù)先用αv-整合素抗體封閉后,MBα及MBc注射后基質(zhì)膠也可呈明顯的超聲顯影,但6min后MBα和MBc均未見明顯的超聲顯影。

13、
　　 4、圖像分析結(jié)果:在高濃度組中,封閉前基質(zhì)膠模型中MBα組呈明顯的超聲顯影,而MBc組僅見輕度的超聲顯影,兩者之間有明顯差異(P<0.05)。預(yù)先單抗封閉αv-整合素后,MBα和封閉前的MBα之間有明顯差異(P<0.05)；而MBc的VI值較封閉前無明顯變化,兩者之間無明顯差異(P>0.05)。低劑量組同樣出現(xiàn)上述結(jié)果。
　　 5、基質(zhì)膠病理及免疫熒光結(jié)果:HE染色切片顯示,小鼠基質(zhì)膠外周帶可見豐富的新生血管,血

14、管中可見紅細(xì)胞的存在；高濃度FGF-2組基質(zhì)膠中新生血管多于低濃度FGF-2組；高濃度組血管密度高,而且更靠近中央?yún)^(qū)。免疫熒光顯示基質(zhì)膠新生血管內(nèi)皮細(xì)胞有大量的αv-整合素,高濃度FGF-2組基質(zhì)膠內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的αv-整合素多于低濃度FGF-2組,封閉后內(nèi)皮細(xì)胞中幾乎不表達(dá)αv-整合素。
　　 6.在超聲造影中,高濃度組封閉前MBα造影VI值是低濃度組封閉前的1.4倍；高濃度組封閉后MBα造影VI值是低濃度組封閉前的1.37倍

15、。在免疫熒光強(qiáng)度測定中,高濃度組封閉前單位面積免疫熒光強(qiáng)度是低濃度組封閉前的1.32倍;高濃度組封閉后是低濃度封閉后的1.33倍。在單位面積血管計(jì)數(shù)中,高濃度組封閉前是封閉后的1.2倍；高濃度組封閉前MBct造影VI值是低濃度組封閉前的1.16倍。
　　 結(jié)論：
　　 1、采用“抗生物素蛋白/生物素復(fù)合體”可實(shí)現(xiàn)抗αv整合素單抗與脂質(zhì)微泡外殼的有效連接而成功構(gòu)建攜帶抗αv-整合素單抗靶向微泡;
　　 2、應(yīng)用攜帶