RecQ解旋酶分子特性的研究.pdf

1、Waston和Crick提出DNA雙螺旋結構后，不僅引導人們發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶，它作用于DNA以一條鏈為模板聚合形成一條新的DNA鏈；而且也讓科學家們尋找到一種酶能夠在DNA復制時破壞互補堿基對的氫鍵結構而打開DNA雙螺旋結構。隨后，相似功能的酶在RNA復制中也被發(fā)現(xiàn)。這類酶被科學家稱為解旋酶。解旋酶是一類能解開核苷酸雙鏈的酶，它廣泛存在于從病毒到人類等多種生物體中。自1976年人類在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了第一個解旋酶，至今已有上百種解旋酶被

2、發(fā)現(xiàn)，而且這一酶家族成員還在不斷擴大。
　　 解旋酶廣泛存在于多種生物體中，有些生物還同時具有多種不同類型的解旋酶。盡管解旋酶種類繁多，人們在研究過程中發(fā)現(xiàn)，這類蛋白酶在其氨基酸序列上有一定的同源性和相似性。分析表明，這些同源序列在進化過程中構成了幾個高度保守的區(qū)域，這些區(qū)域執(zhí)行不同的酶功能。人們根據(jù)酶的二維結構和一級序列，把解旋酶分為幾大家族來分類研究。經過多年的研究，人們發(fā)現(xiàn)解旋酶具有多種功能，在細胞內它們參與DNA復制、修

3、復、轉錄重組以及RNA接拼、核糖體組裝、蛋白質翻譯，端粒穩(wěn)定。最近，還發(fā)現(xiàn)個別解旋酶甚至參與機體天然免疫反應機制。解旋酶已不僅僅只是分開核酸雙鏈結構的一類酶，它的生物功能遠不止此。
　　 解旋酶第二大家族中的RecQ解旋酶亞家族在核酸代謝過程中起了關鍵的作用，這一家族參與DNA復制、DNA修復、重組、轉錄甚至端粒穩(wěn)定機制。人們發(fā)現(xiàn)在人體中存在RECQ1、BLM、WRN、RECQ4和RECQ5這五種RecQ解旋酶家族成員。其中，B

4、LM、WRN、RECQ4編碼基因缺陷會導致人類相應的疾病發(fā)生，它們分別為Bloom綜合癥(BS)、Werner綜合癥(WS)、Rothmund-Thomson綜合癥(RTS)、RAPADILINO綜合癥和Baller-Gerold綜合癥。這些疾病雖然在人類中都是極其罕見的隱形遺傳疾病，但是在分子水平都表現(xiàn)為基因組高度不穩(wěn)定性、染色體異常(染色體斷裂、缺失、重排、姐妹染色體交換等)和對DNA損傷因子敏感性增加。在臨床上表現(xiàn)為過早衰老、II

5、型糖尿病、骨質疏松、動脈硬化和極度容易發(fā)生癌癥。大部分病人都是最終發(fā)生不同癌癥而死亡。這一臨床共同現(xiàn)象引起了人們的關注和研究熱潮。對解旋酶的結構功能、作用機制的研究不僅可以認清核酸代謝過程，還能幫助我們揭示癌癥發(fā)病的某些相關機理。同時了解病毒解旋酶的結構與功能，為抗病毒藥物的研制提供了新的靶點和思路。
　　 解旋酶具有四大基本生物化學活性：NTP水解活性、DNA或RNA結合活性、核酸鏈解鏈活性和核酸鏈退火配對活性。在二價金屬離子

6、和NTP的存在下，解旋酶便表現(xiàn)出水解NTP的性質，大部分酶水解ATP和dATP，一些酶則能水解其他的核苷酸，比如TTP和GTP。當解旋酶與DNA或RNA結合后，利用水解核苷酸產生的能量，推動酶在核酸鏈上的移動，從而解開互補的兩條核酸鏈。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)有些解旋酶在核酸修復過程中能促使核酸鏈配對重組。這使得我們意識到解旋酶在基因穩(wěn)定過程中的作用越來越重要。但是并不是所有的解旋酶成員都表現(xiàn)出這四種基本生化功能，這與酶自身的結構有密切

7、的關系，酶的結構決定了它所能表現(xiàn)的作用機制和生化活性。長期以來，科學家們一直研究探索解旋酶的結構與其功能間的相互關系，力求發(fā)現(xiàn)解旋酶本質的運作機制。
　　 RecQ解旋酶家族盡管蛋白種類繁多，在氨基酸序列上同源性不高，但有限的同源序列構成了數(shù)個典型的功能區(qū)域：從N端向C端方向，分別為位于氨基酸序列中間段的解旋酶核心區(qū)域，RecQ C端區(qū)域和解旋酶RNase D保守區(qū)域，這些區(qū)域具有不同的功能，并相互協(xié)調共同執(zhí)行解旋酶的運作機制。

8、解旋酶核心區(qū)域是解旋酶標志性結構，它由一段高度保守的氨基酸序列組成，含有7個保守區(qū)域，負責結合NTP、NIP水解和DNA結合。RecQ-Ct區(qū)域是RecQ解旋酶家族唯一含有的結構特征，但不是所有RecQ成員都含有這一結構域。RecQ-Ct區(qū)域包含兩個重要的亞結構域：由四個α螺旋和四個保守的半胱氨酸殘基組成的結構平臺，因能特異結合鋅離子而被命名為鋅結合區(qū)域或鋅指結構；序列上不太保守的翼型螺旋亞結構域。目前發(fā)現(xiàn)RecQ-Ct結構域主要負責酶

9、與核酸的結合、酶自身的折疊作用。HRDC區(qū)域位于解旋酶氨基酸序列的C端，在部分RecQ成員中缺失，對這一結構域的認識甚淺，一些研究表明HRDC區(qū)域能夠增強解旋酶對NTP水解和解鏈活性。雖然解旋酶不同的結構域負責不同的酶功能，但解旋酶核心區(qū)域、RecQ-Ct和HRDC區(qū)域并不是各自獨立的，它們互相之間相互作用相互協(xié)調，共同完成酶的生理作用機制。
　　 本文就以RecQ解旋酶家族中BLM、RECQ5和枯草桿菌RecQ(Bacillu

10、s subtilisRecQ)為實驗對象，來研究解旋酶不同結構域之間是如何相互影響、相互牽制。從而了解解旋酶結構與其功能相互間的關系，揭示解旋酶的作用機制。
　　 首先我們把焦點放在RecQ解旋酶的RecQ-Ct區(qū)域，想了解這一區(qū)域是如何與解旋酶核心區(qū)域相互作用，相互之間存在何種聯(lián)系，來共同維持解旋酶整體的酶活性平衡。我們以RECQ5為研究模型，RECQ5是人體5種解旋酶之一，雖然至今未發(fā)現(xiàn)它與任何人類疾病有關，但是有實驗證明R

11、ECQ5與BLM蛋白密切相關，能協(xié)助BLM蛋白維持染色體的平衡。而且RECQ5解旋酶天然存在三種異構體：RECQ5α、REQ5β和RECQ5γ。其中REQ5β最大，含有解旋酶核心區(qū)域和RecQ-Ct區(qū)域，相對的RECQ5α最小，只含有解旋酶核心區(qū)域結構。這兩種異構體成為研究RecQ-Ct結構域功能，和解旋酶核心結構域相互關系最理想的天然模型。實驗結果揭示，RECQ5α既沒有ATP水解能力，也不表現(xiàn)解鏈活性，卻展示出對互補核酸鏈的退火配對

12、作用。REQ5β則表現(xiàn)出較弱的退火配對能力和較強的解鏈活性。一系列實驗證明，其中RecQ-Ct區(qū)域的保守結構一鋅結合區(qū)域起到了重要作用，不僅增加酶對DNA的結合能力，而且起到了分子開關的作用，能夠通過對DNA結合的增強來抑制解旋酶核心區(qū)域的退火配對活性，同時改變蛋白構型啟動解鏈過程。我們率先提出RecQ-Ct區(qū)域鋅指結構與解旋酶核心區(qū)域相互作用的機制模型，初步揭示兩者之間的相互聯(lián)系，了解RecQ解旋酶結構與結構之間，結構與功能間的相互關

13、系。
　　 在對RecQ解旋酶核心區(qū)域與RecQ-Ct區(qū)域認識的基礎上，進一步研究位于氨基酸序列最C端的HRDC區(qū)域的功能，探究HRDC與解旋酶核心區(qū)域、RecQ-Ct區(qū)域的相互關系。本文利用RecQ解旋酶家族中枯草桿菌RecQ(Bacillus subtilis RecQ，SubRecQ)亞家族為研究模型，它由兩個成員組成。這兩種RecQ解旋酶的典型結構差異在于一個含有HRDC區(qū)域，而另一個則HRDC區(qū)域缺失。為研究提供了理想

14、的天然結構模型。結果表明，具有HRDC區(qū)域的SubRecQ酶，表現(xiàn)出解旋酶基本的生化活性，并能有效地解開一些DNA復制與修復中DNA錯誤結構甚至是Holliday結構。相對地，SubRecQ如果缺失HRDC區(qū)域，雖能具有較弱ATP水解活性，解鏈活性，但無法解開某些復雜的DNA復制與修復中間體結構，同時也不具有解開Holliday結構的能力。兩種解旋酶的DNA結合活性與DNA退火配對活性無明顯差異。分析認為，HRDC結構能輔助增強解旋酶的

15、ATP水解活性與解鏈活性，在解開復雜的DNA結構過程中起到了關鍵的作用。
　　 RecQ解旋酶家族中的BLM蛋白是迄今在人體中發(fā)現(xiàn)的5種解旋酶之一，BLM編碼基因的缺陷會導致疾病Bloom綜合癥的發(fā)生。而且BLM蛋白具有RecQ解旋酶家族典型的結構特征，因此它成為理想的研究模型。本實驗室致力于BLM蛋白生化活性的研究已有多年，發(fā)現(xiàn)完整的BLM蛋白能表現(xiàn)出解旋酶全部的基本生物功能，也了解了其各個結構區(qū)域負責哪些酶功能。在研究其結構

16、與功能的相互關系的過程中我們發(fā)現(xiàn)，BLM蛋白的解旋酶核心區(qū)域含有高度保守的精氨酸殘基靠近于與其結合的AIPγ磷酸位置，稱為精氨酸指結構。我們推測這一結構負責ATP的結合與水解活性。蛋白結構分析表明，BLM蛋白解旋酶核心區(qū)域還有兩個保守的精氨酸殘基-R979與R982。突變這兩個殘基位點后，發(fā)現(xiàn)BLM對ATP的水解能力明顯下降，同時喪失解鏈能力，但對ATP結合與DNA結合能力并無影響。R982突變體的ATP水解和解鏈活性減弱幅度比R979

17、突變體更為明顯。運用目前公認的精氨酸指檢測試劑一原釩酸鹽(Vi)探測BLM蛋白的精氨酸指結構，Vi能與鎂離子、ADP和酶形成復合物，從而抑制酶對核苷酸5’端三磷酸催化活性，試驗結果表明Vi能非競爭性抑制R982精氨酸殘基對ATP的水解作用，對R979精氨酸無抑制作用，從而確定BLM蛋白R982氨基酸殘基形成了精氨酸指結構。我們還發(fā)現(xiàn)R982精氨酸指能與其周圍其他一些解旋酶核心區(qū)域的重要殘基相互作用，促進對ATP的招募和水解。在此我們也從

18、一個新的角度揭示解旋酶是如何與ATP和核酸結合啟動ATP的水解，隨后引起蛋白構型變化并將水解產生的化學能源用于解鏈過程的作用機制。
　　 解旋酶的結構是其生化活性的前提，不同保守功能區(qū)域分別具有不同的功能，彼此之間相互作用，互相協(xié)調，來完成酶的整個運作機制。除了解旋酶核心區(qū)域外，RecQ-Ct與HRDC區(qū)域也是解旋酶重要的結構，結構的缺失與突變會不同程度影響酶的功能，增加或者減弱某些酶活性。解旋酶結構特征的完整保證了其在細胞中維