硒蛋白W在雞缺硒性骨骼肌損傷中作用機理研究.pdf

1、硒(Se)是機體必需的微量元素之一，缺硒可導致動物骨骼肌的損傷。大量研究從氧化應激、凋亡、炎癥、硒蛋白等不同角度對缺硒性骨骼肌損傷進行探討，但其確切機制還不清楚。雖然家畜缺硒性骨骼肌損傷早有報道，但在禽類尚缺乏完整、深入的研究揭示其機制。隨著后基因組時代的到來，大數(shù)據(jù)量的多組學分析在疾病診斷與研究中被廣泛應用，基于其高效性、系統(tǒng)性及深入性等特點，組學分析大大促進研究人員對人類及動物疾病相關機理的認識及研究，因此將轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學等組

2、學分析應用到畜禽疾病的研究上就顯得更加重要。
　　硒蛋白W(Selw)是骨骼肌中不可或缺的硒蛋白之一，扮演著重要角色，其在調(diào)節(jié)骨骼肌生理穩(wěn)態(tài)、硒應答以及氧化應激等生理病理過程具有重要作用。然而，作為雞骨骼肌中重要的硒蛋白，Selw在缺硒性骨骼肌損傷中的角色及作用還不得知。因此本實驗通過建立雞缺硒性骨骼肌損傷模型，檢測雞骨骼肌中抗氧化酶活性、凋亡水平、硒蛋白表達、病理學變化、超微結(jié)構(gòu)變化以及離子水平及分布情況，并利用轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)

3、組學及離子組學分析、篩選并驗證缺硒性骨骼肌損傷中差異表達基因及參與的信號通路，以揭示雞缺硒性骨骼肌損傷的可能機制及信號通路。同時建立Selw缺失原代培養(yǎng)雞胚成肌細胞模型，檢測成肌細胞的抗氧化酶活性、凋亡水平、線粒體膜電位、硒蛋白表達、超微結(jié)構(gòu)以及鈣離子水平及鈣通道的表達情況，并利用Realtime PCR方法和Western blot技術對多組學所篩選的信號通路進行驗證，以探討Selw的生物學功能及其在雞缺硒性骨骼肌損傷中扮演的角色及作

4、用。進一步利用(CRISPR)/CRJSPR-associated9(Cas9)技術建立Selw敲除雞胚模型，檢測雞胚骨骼肌中抗氧化酶活性、硒蛋白表達、病理學變化、超微結(jié)構(gòu)以及鈣離子水平及鈣通道的表達，并驗證多組學分析所篩選的相應信號通路，以揭示Selw在雞胚骨骼肌中的生物學功能及其與雞缺硒性骨骼肌損傷的關系。
　　實驗結(jié)果表明:
　　(1)缺硒雞骨骼肌組織轉(zhuǎn)錄組學及蛋白質(zhì)組學共檢測出5個差異的microRNA、725個差異

5、轉(zhuǎn)錄本（mRNA和lncRNA）、450個差異蛋白質(zhì)(P＜0.05)，多組學分析共篩選并驗證了PI3 K-AKT信號通路、鈣信號通路、JNK-FoxO信號通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工處理通路、自噬信號通路、糖代謝信號通路、能量代謝信號通路、泛素化通路等信號通路，表明多種信號通路參與到缺硒誘導的骨骼肌損傷過程中。
　　(2)缺硒雞骨骼肌組織離子水平及分布情況的檢測，發(fā)現(xiàn)鈣離子水平呈現(xiàn)降低趨勢，而V，Cr，Mn，Cu，Cd和Hg均有所升高(P

6、＜0.05)，表明Ca，V，Cr，Mn，Cu，Cd和Hg的失衡與缺硒性骨骼肌損傷具有一定的關系。
　　(3)通過驗證缺硒雞骨骼肌及Selw缺失成肌細胞和雞胚模型中抗氧化酶活性、ROS水平、超微結(jié)構(gòu)、PI3K-AKT通路、鈣信號通路、FoxO信號通路、凋亡通路、自噬通路、代謝通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工處理通路、泛素化通路等信號通路并結(jié)合組學富集分析，證實Selw主要通過激活ROS-JNK-FoxO-Ubi-蛋白酶體/自噬-溶酶體-凋亡/壞

7、死信號通路及抑制ROS-JNK-PI3 K-AKT-mTOR-蛋白合成/能量/糖代謝信號通路導致雞缺硒性骨骼肌損傷的發(fā)生。
　　(4)通過檢測缺硒雞骨骼肌及Selw缺失成肌細胞和雞胚模型中硒蛋白的表達變化，證實Selw通過影響Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Dio1、Dio2、Dio3、Txnrd1、Txnrd3、Selt、Selu、Seln、Sell5、Sels的表達水平參與到缺硒性骨骼肌損傷過程。
　　(5)通過

8、檢測Selw缺失成肌細胞和雞胚模型中鈣離子水平，鈣通道的表達水平及對抑制劑的應答情況，發(fā)現(xiàn)Selw通過影響鈣通道SERCA、CACNA1S、TRPC1、TRPC3活性及水平導致成肌細胞及雞胚鈣流失，并通過調(diào)節(jié)這些鈣通道與缺硒性骨骼肌鈣流失密切關聯(lián)。結(jié)合多組學分析、酶學活性、超微結(jié)構(gòu)等，分析鈣信號與氧化應激間的緊密聯(lián)系，揭示鈣信號在誘導Ca/ROS-JNK-FoxO-Ubi-蛋白酶體/自噬-溶酶體-凋亡/壞死信號通路及抑制Ca/ROS-J