雌孕激素對(duì)上皮鈉通道的調(diào)控作用及機(jī)制.pdf

1、目的：急性呼吸窘迫綜合癥（ARDS）的病因各異，肺內(nèi)源性和外源性因素均可引起，如感染、創(chuàng)傷、休克、誤吸等，但是 ARDS的病理生理學(xué)表現(xiàn)和臨床發(fā)展過程基本上并不依賴于某一個(gè)特定病因，肺泡-毛細(xì)血管的急性損傷是其共同的發(fā)病基礎(chǔ)，最終均導(dǎo)致肺水腫和呼吸衰竭。而急性肺損傷（ALI）是ARDS的早期階段。盡管采用多種手段的綜合治療，ARDS病死率仍居高不下，因此臨床上迫切需要尋找一種新的確切有效的治療方法。
　　目前認(rèn)為能否早期有效控制肺

2、水腫直接影響 ARDS預(yù)后，早期積極控制肺水腫，清除肺泡內(nèi)液體，則呼吸困難時(shí)間縮短，病死率低，反之則高?；A(chǔ)研究認(rèn)為上皮細(xì)胞鈉通道（ENaC）對(duì)肺水腫液的清除起決定性作用，而越來越多的研究認(rèn)為糖皮質(zhì)激素是可以通過上調(diào) ENaC的表達(dá)來減輕肺水腫的，而糖皮質(zhì)激素在細(xì)胞內(nèi)與糖皮質(zhì)激素受體（GR）結(jié)合前，其活性受11β-羥類固醇脫氫酶2(11β-HSD2)調(diào)節(jié)，而甘珀酸（CBX）則可抑制11β-HSD2的活性。臨床中我們觀察到糖皮質(zhì)激素對(duì) A

3、RDS有一定的作用，但副作用比較大。雌激素、孕激素與糖皮質(zhì)激素都屬于類固醇激素，結(jié)構(gòu)有相似之處，且短期使用更安全。在腎臟、結(jié)腸等的研究中雌激素、孕激素也顯示出對(duì) ENaC具有調(diào)控作用，但其對(duì)肺泡 ENaC的研究卻很少，機(jī)制不明確。
　　本研究通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)觀察雌激素和孕激素對(duì)肺水腫、肺泡液體清除（AFC）率影響，雌激素和孕激素對(duì)肺組織及 A549細(xì)胞11β-HSD2活性及 ENaC表達(dá)的影響，對(duì)血清皮質(zhì)酮和ACTH的表達(dá)水平的

4、影響，為ARDS的治療提供新的思路和方法。
　　方法：體內(nèi)試驗(yàn)：雌性未成年SD大鼠35只，隨機(jī)分為7組：對(duì)照組經(jīng)靜脈注入生理鹽水（8ml/Kg），其余各組均經(jīng)靜脈注入油酸（0.1ml/Kg）建立ALI模型，各組大鼠在造模前12小時(shí)、36小時(shí)分別予以皮下注射0.1ml以下不同組合的藥物進(jìn)行干預(yù)：雌激素(0.01 mg/ml)、孕激(10 mg/ml)素、雌激素(0.01 mg/ml)+孕激素(10 mg/ml)、甘珀酸(10 mg/

5、ml)、雌激素(0.01 mg/ml)+孕激素(10 mg/ml)+甘珀酸(10 mg/ml)。對(duì)照組注射相同體積的生理鹽水。建立ALI模型后6小時(shí)處死大鼠，完整取出肺組織，稱取全肺重及體重用于計(jì)算肺系數(shù)，左肺用于測(cè)定AFC，右肺用于觀察肺組織病理改變，測(cè)定肺濕重/干重比值及制作肺組織勻漿用于測(cè)定ENaC水平及11β-HSD2酶的活性。用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）的方法測(cè)定α、β及γ-ENaC mRNA在肺組織中的表達(dá)水平。用

6、蛋白免疫印跡法（Western blot）的方法測(cè)定α、β及γ-ENaC mRNA在肺組織中的表達(dá)水平。同時(shí)留取血液標(biāo)本測(cè)定血清皮質(zhì)酮及促腎上腺皮質(zhì)素（ACTH）的表達(dá)水平。
　　體外實(shí)驗(yàn)：人A549培養(yǎng)于含10％的小牛血清的1640培養(yǎng)液中，置于37℃，5％CO2孵箱中，傳代培養(yǎng)。于實(shí)驗(yàn)0、1、2、4天在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入濃度分別為0、0.001、0.01、0.1、1μM的雌激素和孕激素，于第5天收集細(xì)胞加入3H標(biāo)記的皮質(zhì)醇，測(cè)定

7、11β-HSD2酶的活性，觀察不同濃度雌激素和孕激素對(duì)11β-HSD2酶的活性的影響。然后另取培養(yǎng)的人 A549，于實(shí)驗(yàn)0、1、2、4天在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入不同體外實(shí)驗(yàn)：人A549培養(yǎng)于含10%的小牛血清的1640培養(yǎng)液中，置于37℃，5％CO2孵箱中，傳代培養(yǎng)。于實(shí)驗(yàn)0、1、2、4天在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入濃度分別為0、0.001、0.01、0.1、1μM的雌激素和孕激素，于第5天收集細(xì)胞加入3H標(biāo)記的皮質(zhì)醇，測(cè)定11β-HSD2酶的活性，觀

8、察不同濃度雌激素和孕激素對(duì)11β-HSD2酶的活性的影響。然后另取培養(yǎng)的人 A549，于實(shí)驗(yàn)0、1、2、4天在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入不同組合但濃度為1μM的藥物：雌激素、孕激素、雌激素+孕激素、甘珀酸組及雌激素+孕激素+甘珀酸，對(duì)照組不加入任何藥物。于第5天收集細(xì)胞加入3H標(biāo)記的皮質(zhì)醇和皮質(zhì)酮，測(cè)定11β-HSD2酶的活性，觀察雌激素和孕激素對(duì)11β-HSD2酶的活性、ENaC表達(dá)水平的影響。
　　結(jié)果：體內(nèi)試驗(yàn)：與對(duì)照組比較，ALI組

9、出現(xiàn)明顯肺水腫、出血及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，其肺濕重/干重比值、肺系數(shù)，血清ACTH表達(dá)水平及肺組織中11β-HSD2活性明顯增加，而AFC、肺組織α-ENaC mRNA及蛋白表達(dá)及血清皮質(zhì)酮水平明顯降低（P<0.05）；而給予雌激素和孕激素干預(yù)后，其肺水腫、出血及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)比ALI組要輕，肺濕重/干重比值、肺系數(shù)，血清ACTH表達(dá)水平及肺組織中11β-HSD2活性較ALI組均明顯下降，而AFC、肺組織α-ENaC mRNA和蛋白表達(dá)水平、γ

10、-ENaC蛋白水平及血清皮質(zhì)酮水平較ALI組明顯增加，尤其以雌激素+孕激素組明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而β-ENaCmRNA和蛋白及γ-ENaCmRNA則沒有明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在給予雌激素+孕激素干預(yù)的基礎(chǔ)上加用11β-HSD2抑制劑CBX并沒有更多的抑制11β-HSD2活性。
　　體外實(shí)驗(yàn)：雌激素和孕激素均可抑制A549cell中11β-HSD2活性，并顯示出劑量依賴性。兩者均可上調(diào)α-E

11、NaC mRNA及蛋白的表達(dá)，而對(duì)β及γ-ENaC mRNA和蛋白沒有影響。聯(lián)合應(yīng)用雌激素和孕激素，其抑制11β-HSD2活性及上調(diào)α-ENaC mRNA及蛋白的效應(yīng)更明顯。加用甘珀酸并未增加其對(duì)11β-HSD2活性的抑制作用。
　　結(jié)論：雌激素和孕激素可通過抑制11β-HSD2活性，增加有活性的糖皮質(zhì)激素的量，從而上調(diào)α-ENaC mRNA及蛋白的表達(dá)，促進(jìn)AFC，減輕肺水腫，為ALI/急性呼吸窘迫綜合癥（ARDS）的治療提供新