痹腫消湯干預(yù)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜病變的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的： (1)研究膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen．induced arthritis，CIA)大 鼠滑膜組織蛋白質(zhì)表達(dá)，探討類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rlmurtmtoid arthritis，RA)的發(fā)病機(jī)制； (2)分析痹腫消湯(Bizhongxiao decoction，BZXD)干預(yù)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜病變的差異蛋白質(zhì)表達(dá)，探討痹腫消湯治療RA的作用機(jī)理。 方法： (1)采用牛Ⅱ型膠原(bovin

2、eⅡ collgen,BⅡC)混合完全弗氏佐 劑(complete Freund's adjuvant,CFA)皮下注射大鼠復(fù)制實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型。模型成功后隨機(jī)分為兩組，一組為痹腫消湯組(n=30，簡稱治療組)，灌服BZXD，另一組為CIA模型組(n=30，簡稱模型組)，灌服等劑量雙蒸水。正常對(duì)照組(簡稱正常組，n=30)大鼠不作處理。 (2)觀察三組大鼠一般情況、關(guān)節(jié)炎指數(shù)積分、足爪腫脹度、病理形態(tài)學(xué)改變。在免疫后第10

3、天、15天、20天、25天、30天、35天、40天、45天分別記錄大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)積分；每周測體重及足爪腫脹程度；在免疫后第25天、35天、45天分批處死大鼠，用HE染色法觀察各組踝關(guān)節(jié)病理形態(tài)學(xué)改變。 (3)應(yīng)用雙向凝膠電泳技術(shù)(two-dimensional gel electrophoresis，2DE)分別分離正常組、模型組及治療組大鼠不同時(shí)間膝關(guān)節(jié)滑膜總蛋白，膠體考染顯色，Image Scan對(duì)膠體考染的2-DE膠掃描以

4、獲取電子圖像，Pdquest7.2圖像分析軟件比較分析此三組不同時(shí)間雙向凝膠電泳圖譜并識(shí)別差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(matrix-assisted laser desorption／ionization time-of-flight mass spectrometry，MAI,DI-TOF-MS)得到相應(yīng)的肽質(zhì)量指紋圖譜(peptide mass fingerprinlt,PMF)，然后搜索數(shù)據(jù)庫鑒定

5、部分差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，運(yùn)用western blotting方法驗(yàn)證差異表達(dá)蛋白。 結(jié)果： 1．CIA模型復(fù)制：采用BIIC混合CFA皮下注射SD大鼠成功復(fù)制CIA模型，成功率達(dá)88.6％。 (1)一般情況觀察：模型組大鼠精神欠佳，飲食減少，平均體重較治療組輕(P<0.05)，體毛欠光澤，后期可見毛發(fā)枯燥，治療組未見以上情況。模型組大鼠于免疫后第3周、第4周、第5周、第6周體重增長較正常組緩慢(P<0.05)，第1周和

6、第2周體重增長差異無顯著性(P>0.05)；治療組大鼠于第5、6周體重增長較模型組明顯，差異有顯著性(P<0.05)，其余時(shí)間點(diǎn)差異不顯著。 (2)關(guān)節(jié)炎指數(shù)積分評(píng)定：CIA大鼠關(guān)節(jié)炎體征于免疫后8-l0天開始出現(xiàn)。免疫后10d，模型組，治療組的關(guān)節(jié)炎指數(shù)積分增加。模型組于免疫后25天關(guān)節(jié)炎指數(shù)積分達(dá)到高峰，30天開始下降；治療組大鼠A工積分與模型組比較，在20天前無明顯區(qū)別，差異無顯著性(P>0.05)，于25天左右達(dá)高峰，但

7、仍較模型組低，差異有顯著性(P<0.05)。BZXD治療兩周后，關(guān)節(jié)炎指數(shù)積分開始下降。治療組大鼠AI積分于20天、30天、35天、40天、45天均明顯低于模型組(P<0．05)。 (3)足爪腫脹度測量：模型組大鼠于免疫后第2周、第3周、第4周、第5周、第6周足爪腫脹較正常組明顯(P<0.05)；治療組大鼠于第5周、第6周足爪腫脹較模型組減輕(P<0.05)，其余時(shí)間點(diǎn)差異無顯著性。(4)病理組織學(xué)觀察：正常大鼠滑膜組織未見明顯

8、的新生血管及炎癥細(xì)胞浸潤，模型組25天有明顯血管增生、滑膜增厚，炎性細(xì)胞浸潤、水腫，隨著關(guān)節(jié)癥狀的加重，新生血管逐漸增多、血管擴(kuò)張、充血，大量淋巴細(xì)胞浸潤。治療組滑膜組織可見少量新生血管及炎癥細(xì)胞浸潤，滑膜輕度增厚，于35d后可見新生血管減少，炎癥減輕，滑膜變薄。痹腫消湯能減輕cIA關(guān)節(jié)滑膜損傷。 2．關(guān)節(jié)滑膜組織雙向凝膠電泳圖譜的建立和圖象分析： 建立了正常組、模型組和治療組關(guān)節(jié)滑膜的雙向凝膠電泳圖譜。 在相同

9、的設(shè)定值時(shí)檢測到蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)分別為：正常組947±39個(gè)，模型組25天、35天、45天分別為1019±22、1070±44、994±41個(gè)，治療組25天、35天、45天分別為1008±28、1053±24、1031±52個(gè)。經(jīng)過背景消減后，分別將其中的一塊膠作為參考膠進(jìn)行3塊膠間的蛋白質(zhì)點(diǎn)的匹配，結(jié)果得到正常組的平均匹配點(diǎn)數(shù)為871±35個(gè)，模型組25天、35天、45天分別為910±20、959±39、905±37個(gè)，治療組25天、35天

10、、45天分別為884±24、953±22、971±49個(gè)，其平均匹配百分率分別為92％、89.3％、89.6％、91％、87.7％、90.5％、94.2％。不同膠間蛋白質(zhì)點(diǎn)在等電聚焦(isoelectric focusing，IEF)方向的偏差是0.896±0.217mm，在十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodiumdo-decylsufate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PA．GE

11、)方向的偏差為1-102±0.104ram。 3．各組2-DE圖譜差異點(diǎn)分析： 比較分析三組滑膜2-DE圖譜，模型組25天與正常組之間有380個(gè)差異點(diǎn)，44個(gè)在模型組表達(dá)上調(diào)，336個(gè)表達(dá)下調(diào)。治療組25天與模型組25天之間有290個(gè)差異點(diǎn)，189個(gè)在治療組表達(dá)上調(diào)，101個(gè)表達(dá)下調(diào)。模型組35天與正常組之間有284差異點(diǎn)，180個(gè)在模型組表達(dá)上調(diào)，104個(gè)表達(dá)下調(diào)；治療組35天與模型組35天之間有205個(gè)差異點(diǎn)，52個(gè)在治療

12、組表達(dá)上調(diào)，153個(gè)表達(dá)下調(diào)。模型組45天與正常組之間有193個(gè)差異點(diǎn)，123個(gè)在模型組表達(dá)上調(diào)，70個(gè)表達(dá)下調(diào)；治療組45天與模型組45天之間有328個(gè)差異點(diǎn)，174個(gè)在治療組表達(dá)上調(diào)，147個(gè)表達(dá)下調(diào)，7個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)只在模型組表達(dá)。 4．差異蛋白質(zhì)點(diǎn)質(zhì)譜鑒定及蛋白功能分類： 發(fā)現(xiàn)并鑒定了正常組、CIA模型組和治療組大鼠滑膜的差異表達(dá)大于2倍的蛋白質(zhì)點(diǎn)55個(gè)。根據(jù)NCBI、MSDB數(shù)據(jù)庫中提供的的信息，這些差異蛋白質(zhì)的功

13、能涉及物質(zhì)代謝、能量產(chǎn)生、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、抗氧化應(yīng)激、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞骨架等。其中g(shù)elsolin、lamin A、annexin 1、annexin V、peroxiredoxin 1、peroxiredoxin 2、peroxiredoxin 6、catalase、apolipoprotein A-I、aldolase A、glyceraldehyde 3-phosphate dehydrog-enase、phosphoglycerate

14、kinase、Rho A、preprohaptoglobin等蛋白可能與CIA滑膜病變密切相關(guān)。5．差異蛋白驗(yàn)證結(jié)果： (1)造模25天后，模型組annexin V表達(dá)與正常組相比開始下調(diào)(P<0.05)，治療組annexin V表達(dá)強(qiáng)于模型組(P<0.05)；隨著免疫時(shí)間的延長，模型組annexin V表達(dá)逐漸降低(P<0.05),治療組則逐漸增強(qiáng)(P0.05)。 (2)造模25

15、天后，模型組adolase A表達(dá)與正常組比較開始上調(diào)(P<0.05)，治療組adolase A表達(dá)低于模型組(P<0.05)；隨著免疫時(shí)間的延長，模型組adolaseA表達(dá)逐漸上調(diào)(P<0.05)，治療組則逐漸降低(P<0.05)，接近于正常組adolase A表達(dá)水平。Western bloRing方法證實(shí)annexin V、adolase A在正常組、模型組、治療組的表達(dá)水平與2DE結(jié)果一致。 結(jié)論： (1)以BI

16、IC混合CFA皮下注射SD大鼠成功復(fù)制了CIA動(dòng)物模型，該模型具有RA代表性特點(diǎn)，可作為RA研究用。 (2)建立了CIA大鼠模型關(guān)節(jié)滑膜的雙向凝膠電泳圖譜，鑒定了55個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，提示RA模型關(guān)節(jié)滑膜病變是一個(gè)多蛋白質(zhì)參與的復(fù)雜過程。痹腫消湯可調(diào)節(jié)RA大鼠滑膜組織多種蛋白質(zhì)表達(dá)，提示該方藥具有多靶點(diǎn)的作用機(jī)制。 (3)Annexin V、aldolase A的免疫印跡驗(yàn)證結(jié)果與蛋白質(zhì)分析結(jié)果相一致，證明了蛋白質(zhì)組學(xué)技