青蒿琥酯干預(yù)TRAF6在大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、目的：類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthriris,RA)是一種以致殘性多關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的自身免疫性疾病,本病以慢性、對(duì)稱性、破壞性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn),其中靶關(guān)節(jié)為近端指間關(guān)節(jié)、腕關(guān)節(jié)和掌指關(guān)節(jié),其他如顳關(guān)節(jié)、肘關(guān)節(jié)、踝和足關(guān)節(jié)也常常受累。RA患者還可出現(xiàn)關(guān)節(jié)外表現(xiàn)如發(fā)熱、貧血、皮下結(jié)節(jié)、血管炎,肺間質(zhì)病變等。RA主要病理變化為關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥,初期滑膜充血、水腫、增厚,血管翳形成,軟骨和軟骨下骨破壞,其破壞是類(lèi)似于腫

2、瘤性的破壞,是高度致殘性疾病,其中新生血管形成與細(xì)胞外基質(zhì)降解是骨侵蝕破壞過(guò)程中兩個(gè)至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。減少炎性因子的釋放及抑制血管翳形成從而減緩骨侵蝕為治療的靶位,臨床上使用腫瘤壞死因子-α拮抗劑聯(lián)合慢作用抗風(fēng)濕藥來(lái)治療以預(yù)防、延緩骨質(zhì)破壞從而達(dá)到阻止骨質(zhì)破壞。但腫瘤壞死因子-α拮抗劑價(jià)格昂貴,疾病的治療成本高,故迫切需要一個(gè)既能防止骨破壞的發(fā)生且能適合我國(guó)國(guó)情、為廣大患者能負(fù)擔(dān)得起并具有我國(guó)知識(shí)產(chǎn)權(quán)的藥物。本實(shí)驗(yàn)旨在研究青蒿琥酯能否替代

3、腫瘤壞死因子-α拮抗劑成為廣大RA患者能用得起的抗風(fēng)濕藥物,減少患者的致殘率、提高患者的生活質(zhì)量,減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。青蒿琥酯是青蒿素的一種半合成衍生物。青蒿素具有廣泛的生物學(xué)作用:如抑制細(xì)胞增殖、抗血管增生、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。目前已經(jīng)有大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)青蒿琥酯為一種低毒、高效的潛在免疫抑制劑[1],并且研究發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯能通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)途徑抑制LPS誘導(dǎo)的RA滑膜細(xì)胞分泌TNF-α[2],從而發(fā)揮抑制RA滑膜炎癥的

4、作用[3],同時(shí)還可通過(guò)抑制IL-17、TNF-α分泌及其兩者的協(xié)同性而抑制RA滑膜細(xì)胞分泌炎癥因子,從而減少血管翳的形成及對(duì)軟骨及骨的侵蝕[45]。
　　TRAF6屬于TOLL/IL-R家族,通過(guò)調(diào)控B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)通路,影響細(xì)胞的生存、分化、增殖和死亡,參與調(diào)控多個(gè)生物學(xué)過(guò)程以對(duì)機(jī)體的免疫功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。抑制TRAF6的表達(dá)則可抑制炎性因子的產(chǎn)生,可視為RA治療的上游靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)研究青蒿琥酯對(duì)TRAF6的表達(dá)影響,明確青蒿琥酯

5、確切的作用靶位,進(jìn)一步探討其機(jī)制,從而為今后應(yīng)用青蒿琥酯治療RA提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　本研究通過(guò)建立膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的大鼠動(dòng)物模型[6],觀察不同劑量青蒿琥酯干預(yù)下TRAF6在大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞中的表達(dá),探討青蒿琥酯對(duì)TRAF6相關(guān)信號(hào)通路活化的調(diào)控作用;同時(shí)將大鼠的滑膜細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng),予不同劑量的青蒿琥酯干預(yù)滑膜細(xì)胞,通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)檢測(cè)TRAF6在大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞中的基因表達(dá),用w

6、esternblotting檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)TRAF6在大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞中蛋白的表達(dá),旨在為應(yīng)用青蒿琥酯治療RA提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：建立Ⅱ型膠原誘導(dǎo)(collageninducedarthritis,CIA)的雄性Wistar大鼠模型[7],隨機(jī)分為正常對(duì)照組、CIA模型對(duì)照組、5mg/kg/d青蒿琥酯組、10mg/kg/d青蒿琥酯組、20mg/kg/d青蒿琥酯組、甲氨蝶吟(MTX)組、硫酸羥氯喹組、甲基潑尼松龍組。

7、進(jìn)行21w體內(nèi)實(shí)驗(yàn),初次免疫后3w開(kāi)始給藥。治療過(guò)程中連續(xù)對(duì)大鼠的關(guān)節(jié)炎癥程度進(jìn)行評(píng)分,測(cè)量右后肢的踝關(guān)節(jié)腫脹度。治療21w后將全部動(dòng)物處死取材,進(jìn)行滑膜細(xì)胞原代培養(yǎng),在體外細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定后,分別加入不同劑量的青蒿琥酯,通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)檢測(cè)TRAF6在大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞中的基因表達(dá),用westernblotting檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)TRAF6在大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞中蛋白的表達(dá),同時(shí)取活體人的類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎

8、病人的滑膜組織進(jìn)行原代培養(yǎng),作對(duì)比實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　1.CIA大鼠造模成功率達(dá)93.3％(56/61)。
　　2.關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI):各治療組AI均較模型組有明顯改善,20mg/kg/d青蒿琥酯組優(yōu)于5mg/kg/d青蒿琥酯組、10mg/kg/d青蒿琥酯組、MTX組、羥氯喹組(P<0.05),踝關(guān)節(jié)腫脹度改善程度最明顯(P<0.05)。20mg/kg/d青蒿琥酯組與甲基潑尼松龍組(P>0.5)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

9、>　　3.青蒿琥酯干預(yù)下TRAF6在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞中基因的表達(dá)。
　　(1)選擇人和鼠的第五代生長(zhǎng)良好的滑膜細(xì)胞,用不同劑量的青蒿琥酯進(jìn)行干預(yù),各治療組TRAF6表達(dá)下降,細(xì)胞因子分泌減少,成纖維樣滑膜細(xì)胞減少,各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　(2)在各治療組TRAF6表達(dá)較CIA模型組下降,各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。20mg/kg/d青蒿琥酯組TRAF6表達(dá)低于5mg/kg/d青蒿琥酯、

10、10mg/kg/d青蒿琥酯、MTX、硫酸羥氯喹及甲基潑尼松龍組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　4.青蒿琥酯干預(yù)下TRAF6在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞中蛋白的表達(dá)
　　(1)選擇人和鼠的第五代生長(zhǎng)良好的滑膜細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),各治療組TRAF6表達(dá)下降,炎癥因子分泌減少,增生的滑膜細(xì)胞減少,各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　(2)在各治療組TRAF6表達(dá)較CIA模型組下降,各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0

11、5)。20mg/kg/d青蒿琥酯組TRAF6水平低于5mg/kg/d青蒿琥酯、10mg/kg/d青蒿琥酯、MTX、羥氯喹及甲基潑尼松龍組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　5.青蒿琥酯干預(yù)下TRAF6在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞中的表達(dá)下降。
　　結(jié)論：
　　1.在CIA大鼠模型中:關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)≥6分以上;關(guān)節(jié)腫脹度,骨質(zhì)疏松及關(guān)節(jié)間隙狹窄均較其它治療組嚴(yán)重。
　　2.5mg/kg/d青蒿琥酯、10mg/

12、kg/d青蒿琥酯滑膜炎癥、軟骨及骨組織侵蝕有所減輕;尤其以20mg/kg/d青蒿琥酯組關(guān)節(jié)腫脹度、滑膜炎癥、軟骨及骨組織侵蝕明顯改善,體重未減輕,鉬鈀檢測(cè)未見(jiàn)骨質(zhì)疏松。青蒿琥酯通過(guò)調(diào)控B淋巴細(xì)胞抑制TNF-a分泌及其兩者的協(xié)同性來(lái)下調(diào)TRAF6的表達(dá),抑制RA滑膜細(xì)胞分泌炎癥因子,從而減少血管翳的形成及對(duì)軟骨及骨的侵蝕。
　　3.MTX組在改善關(guān)節(jié)炎指數(shù),踝關(guān)節(jié)腫脹度,抑制TNF-a分泌,滑膜炎癥、軟骨及骨組織侵蝕明顯改善。但是容

13、易導(dǎo)致骨質(zhì)疏松,體重減輕。
　　4.羥氯喹組在改善關(guān)節(jié)炎指數(shù),踝關(guān)節(jié)腫脹度等方面的作用較弱,它可以抑制TNF-a分泌,抑制炎癥因子的釋放,從而發(fā)揮治療RA的作用。
　　5.甲基潑尼松龍組在改善關(guān)節(jié)炎指數(shù),踝關(guān)節(jié)腫脹度,抑制TNF-a分泌,滑膜炎癥、軟骨及骨組織侵蝕明顯改善。但是更容易導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。
　　6.青蒿琥酯干預(yù)下TRAF6在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)人及鼠的滑膜細(xì)胞中的表達(dá)隨著劑量的加大而明顯下降。
　　7.青蒿琥酯